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实验51 多酚氧化酶活性的测定(氧电极法)

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2902

 

实验51 多酚氧化酶活性的测定(氧电极法)

 

原理

 

  多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶,能使一元酚和二元酚氧化生成醌。多酚氧化酶活性可以用氧电极测量反应耗氧的速度,或用比色法测量产物的形成,常用的底物如儿茶酚(邻苯二酚)和多巴(3,4-二羟苯丙氨酸)。

 

 

仪器药品

 

  测氧仪        记录仪

  超级恒温水浴     离心机

  磁力搅拌器      匀浆机

  反应杯        微量注射器

  不溶性PVP(聚乙烯吡咯烷酮,polyvinylpyrrolidone)

  1mmol/L儿茶酚:0.11g儿茶酚溶于1000ml0.1mol/L磷酸缓冲液中,pH6.5。

  0.1mol/L磷酸缓冲液,pH6.5(见附表2)。

 

操作步骤

 

  1.粗酶的制备

  (1)称取马铃薯块茎20g,加不溶性PVP2g(事先用蒸馏水浸洗,然后过滤以除去杂质),磷酸缓冲液100ml,于匀浆机中打碎成匀浆,用尼龙网袋(或纱布袋)过滤,得滤液。

  (2)滤液中加入30%饱和度硫酸铵(见附表8),离心除去沉淀,上清液再加硫酸铵使达60%饱和度,离心收集沉淀。

  (3)将所得沉淀溶于少量0.01mol/L磷酸缓冲液中(pH6.5),即为粗制酶液,于同样缓冲液中透析过夜,其间更换透析溶液3─4次。

  2.酶活性测定

  (1)按实验88所述,将测氧仪、记录仪、恒温水浴(25℃)的管路和电(线)路连接好,然后进行仪器的标定,以求得记录纸上每小格相当的含氧量。

  (2)测定酶活性时,先于反应杯中倒入底物儿茶酚,待记录仪上画出一条直线,用微量注射器经小孔注入合适浓度的酶液10μl,记录氧消耗曲线。

  (3)取氧消耗曲线的直线部分,计算酶活性大小,酶活性以耗O2 μl/min·ml酶液表示之。

 

 

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