实验51 多酚氧化酶活性的测定(氧电极法)
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实验51 多酚氧化酶活性的测定(氧电极法)
原理
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶,能使一元酚和二元酚氧化生成醌。多酚氧化酶活性可以用氧电极测量反应耗氧的速度,或用比色法测量产物的形成,常用的底物如儿茶酚(邻苯二酚)和多巴(3,4-二羟苯丙氨酸)。
仪器药品
测氧仪 记录仪
超级恒温水浴 离心机
磁力搅拌器 匀浆机
反应杯 微量注射器
不溶性PVP(聚乙烯吡咯烷酮,polyvinylpyrrolidone)
1mmol/L儿茶酚:0.11g儿茶酚溶于1000ml0.1mol/L磷酸缓冲液中,pH6.5。
0.1mol/L磷酸缓冲液,pH6.5(见附表2)。
操作步骤
1.粗酶的制备
(1)称取马铃薯块茎20g,加不溶性PVP2g(事先用蒸馏水浸洗,然后过滤以除去杂质),磷酸缓冲液100ml,于匀浆机中打碎成匀浆,用尼龙网袋(或纱布袋)过滤,得滤液。
(2)滤液中加入30%饱和度硫酸铵(见附表8),离心除去沉淀,上清液再加硫酸铵使达60%饱和度,离心收集沉淀。
(3)将所得沉淀溶于少量0.01mol/L磷酸缓冲液中(pH6.5),即为粗制酶液,于同样缓冲液中透析过夜,其间更换透析溶液3─4次。
2.酶活性测定
(1)按实验88所述,将测氧仪、记录仪、恒温水浴(25℃)的管路和电(线)路连接好,然后进行仪器的标定,以求得记录纸上每小格相当的含氧量。
(2)测定酶活性时,先于反应杯中倒入底物儿茶酚,待记录仪上画出一条直线,用微量注射器经小孔注入合适浓度的酶液10μl,记录氧消耗曲线。
(3)取氧消耗曲线的直线部分,计算酶活性大小,酶活性以耗O2 μl/min·ml酶液表示之。