实验51 多酚氧化酶活性的测定（氧电极法）

实验51 多酚氧化酶活性的测定（氧电极法）

原理

　　多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。多酚氧化酶活性可以用氧电极测量反应耗氧的速度，或用比色法测量产物的形成，常用的底物如儿茶酚（邻苯二酚）和多巴（3，4－二羟苯丙氨酸）。

仪器药品

　　测氧仪 　　　　　　　记录仪

　　超级恒温水浴 　　　　离心机

　　磁力搅拌器 　　　　　匀浆机

　　反应杯　　　　　　　 微量注射器

　　不溶性PVP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinylpyrrolidone)

　　1mmol/L儿茶酚：0.11g儿茶酚溶于1000ml0.1mol/L磷酸缓冲液中，pH6.5。

　　0.1mol/L磷酸缓冲液，pH6.5（见附表2）。

操作步骤

　　1．粗酶的制备

　　(1)称取马铃薯块茎20g，加不溶性PVP2g（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质），磷酸缓冲液100ml，于匀浆机中打碎成匀浆，用尼龙网袋（或纱布袋）过滤，得滤液。

　　(2)滤液中加入30%饱和度硫酸铵（见附表8），离心除去沉淀，上清液再加硫酸铵使达60%饱和度，离心收集沉淀。

　　(3)将所得沉淀溶于少量0.01mol/L磷酸缓冲液中(pH6.5)，即为粗制酶液，于同样缓冲液中透析过夜，其间更换透析溶液3─4次。

　　2．酶活性测定

　　(1)按实验88所述，将测氧仪、记录仪、恒温水浴(25℃)的管路和电（线）路连接好，然后进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量。

　　(2)测定酶活性时，先于反应杯中倒入底物儿茶酚，待记录仪上画出一条直线，用微量注射器经小孔注入合适浓度的酶液10μl，记录氧消耗曲线。

　　(3)取氧消耗曲线的直线部分，计算酶活性大小，酶活性以耗O₂ μl/min·ml酶液表示之。