实验50 过氧化氢酶活性的测定（氧电极法）

 

实验50 过氧化氢酶活性的测定（氧电极法）

 

原理

 

　　过氧化氢酶广泛存在于植物的所有组织中，能将过氧化氢分解为氧和水，可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光光度法等。用氧电极法测量放氧速度，方法灵敏而快速。放氧速度与过氧化氢酶活性成正比。

 

仪器药品

 

　　氧电极仪 　　　　　　记录仪

　　电磁搅拌器　　　　　 超级恒温水浴

　　注射器、　　　　　　 微量注射器 　　　　容量瓶

　　反应杯　　　　　　　 亚硫酸钠

　　过氧化氢酶

　　50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0（见附表2）。

　　50mmol/L过氧化氢溶液：取1.4ml30%H₂ O₂ 用磷酸缓冲液定容至250ml即得。

　　标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(Sigma)1.0mg(110U/mg)，溶于50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)11ml中，使酶浓度为10U/ml。

 

操作步骤

 

　　1．仪器的标定

　　按实验88步骤进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量。

　　2．绘制酶活性标准曲线

　　(1)在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液，开启电磁搅拌器搅动10分钟，插入电极，吸去溢出在电极外面的溶液，调节移位旋钮，使记录笔位于满刻度的10─20%左右，使记录纸走动，1─2分钟后温度达到平衡，记录笔画出直线。

　　(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110U/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。

　　(3)根据上述同样步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μl（例如浓度为20、30、40、50U/ml等），记录氧释放曲线。

　　(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。

　　(5)以过氧化氢酶活性单位为横坐标，每分钟氧的释放量为纵坐标，绘制标准曲线。

　　3．样品测定

　　(1)在反应怀内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10分钟，插上电极，待记录为一直线后，注入10μl合适浓度的待测酶液样品，立即记下最初90秒钟内的放氧曲线。

　　(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。

　　(3)如果没有标准的过氧化氢酶，不能计算酶活性单位时，也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。