过氧化氢酶活性的测定(氧电极法)
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过氧化氢酶广泛存在于植物 的所有组织中,能将过氧化氢分解为氧和水,可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光光度法等。用氧电极法测量放氧速度,方法灵敏而快速。放氧速度与过氧化氢酶活性成正比。
仪器药品
氧电极仪 记录仪
电磁搅拌器 超级恒温水浴
注射器、 微量注射器 容量瓶
反应杯 亚硫酸钠
过氧化氢酶
50mmol/L磷酸缓冲液 ,pH7.0(见附表2)。
50mmol/L过氧化氢溶液:取1.4ml30%H2O2用磷酸缓冲液定容至250ml即得。
标准过氧化氢酶溶液:称取过氧化氢酶(Sigma)1.0mg(110U/mg),溶于50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)11ml中,使酶浓度为10U/ml。
操作步骤
1.仪器的标定
按实验88步骤进行仪器的标定,以求得记录纸上每小格相当的含氧量。
2.绘制酶活性标准曲线
(1)在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液,开启电磁搅拌器搅动10分钟,插入电极,吸去溢出在电极外面的溶液,调节移位旋钮,使记录笔位于满刻度的10─20%左右,使记录纸走动,1─2分钟后温度达到平衡,记录笔画出直线。
(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110U/ml过氧化氢酶,立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。
(3)根据上述同样步骤,注入不同浓度的过氧化氢酶10μl(例如浓度为20、30、40、50U/ml等),记录氧释放曲线。
(4)取放氧曲线的直线部分,根据其斜率及走纸速度,计算每分钟氧的释放量。
(5)以过氧化氢酶活性单位为横坐标,每分钟氧的释放量为纵坐标,绘制标准曲线。
3.样品测定
(1)在反应怀内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10分钟,插上电极,待记录为一直线后,注入10μl合适浓度的待测酶液样品,立即记下最初90秒钟内的放氧曲线。
(2)根据样品的放氧曲线,计算得到每分钟的放氧量,在标准曲线上查得酶活性大小。
(3)如果没有标准的过氧化氢酶,不能计算酶活性单位时,也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。
实验作业
1.生物体内的过氧化氢酶有何生理意义?
2.过氧化氢酶与植物的其他代谢有何联系?
3.在测定时为什么只要记录最初90秒钟的放氧曲线来计算酶活性?
参考文献
1.Goldstein, D. .D.: 1968. .Anal.Biochem., 24:431─437.
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3.Rorth Mikael and P. .K. .Jensen:1967. .Biochem, Biophys. .Acta, 139:171─173.