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植物体内抗坏血酸氧化酶活性的测定实验

相关实验:植物体内抗坏血酸氧化酶活性的测定实验

最新修订时间:

原理

抗坏血酸氧化酶在有氧情况下,能氧化抗坏血酸成脱氢抗坏血酸,同时促进其氢与空气中的氧结合成水。

抗坏血酸氧化酶的测定是在该酶的最适pH及适宜的温度下,向反应瓶中加入一定量的底物(抗坏血酸)及酶提取液,让酶作用一段时间,然后测定底物被消耗的数量来计算酶的活性。抗坏血酸被消耗的量,可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。反应式如下:
上述式中I2来自以下反应:

KIO3 + 5KI + 6HPO3 --→ 3I2 + 6KPO3 + 3H2O

材料与仪器

水稻黄化幼苗 马铃薯块茎 植物叶片
磷酸盐缓冲液 抗坏血酸 偏磷酸 淀粉溶液 碘酸钾配制 碘液配制
研钵 50 ml量筒 50 ml三角瓶 微量滴定管 滴定架 移液管 移液管架 恒温水浴 洗耳球

步骤


一、实验步骤

1. 酶液提取

称取新鲜样品(水稻黄化苗2~3g,马铃薯块茎用5g)剪碎置研钵中,加少量石英砂及pH6的磷酸缓冲液,迅速研磨成匀浆(事先将缓冲液用冰水冷却,不使研磨时温度增高)。把全部材料用缓冲液洗入50 ml容量瓶中,定容至刻度。放在18~20℃水浴上浸提30min(其间摇动数次)。然后将上清液(酶浸提液)用棉花过滤于干净的三角瓶中备用。

2. 酶活性的测定

取3个50 ml三角瓶,标上号码,按下表准确加入各项试液:


先在各瓶中加入pH6磷酸缓冲液4 ml,0.1%抗坏血酸2 ml, 并向3号瓶加入10%三氯乙酸1 ml,以每隔1 min在各瓶中依次加入酶液3 ml(视酶活性增减酶用量),准确记录加入酶液的时间,摇勺后将各瓶在18~20℃水浴中酶促反应5 min后,立即向1、2号瓶各加入10﹪三氯乙酸1 ml,以终止酶的活动,然后各瓶加入1%淀粉液3滴作指示剂,用微量滴定管以mol碘液进行滴定,以出现浅兰色为滴定终点。记录滴定值。

常见问题

酶活性的计算:

来源:丁香实验

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