实验91 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

 

实验91 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

 

原理

 

　　聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAA）凝胶是丙烯酰胺（acry—lamide，Acr），在交联剂甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide，Bis）的作用下经聚合而形成的一种大分子化合物。

　　Acr的聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化诱发剂系统产生自由基，过硫酸铵—TEMED（四甲基乙二胺）和核黄素—TEMED就是这样的催化诱发系统。前者发生化学聚合作用，后者发生光致聚合作用。化学聚合时诱发剂TEMED加速过硫酸铵形成自由基，使Acr单体转变为自由基态而导致聚合作用。溶液的pH对聚合作用是重要的，因为过低pH没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时，在加过硫酸铵之前，混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用，常用于制备浓缩胶，因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时，产生自由基使Acr发生聚合作用。

　　　

　　PAGE通常包括两种孔度的凝胶，即大孔度的浓缩胶和小孔度的分离胶，浓缩胶的浓度通常PAA量为4.5%，交联剂含量为2.5%。分离胶的浓度则因样品的分子量而不同，高浓度常用于分离低分子量蛋白质。PAA量为7.5%的分离胶，对大多数生物体内的蛋白质的分离能有满意的结果。

　　根据样品分子量的大小可按下表选择合适的分离胶浓度。

　　凝胶浓度和交联剂浓度按下式计算：

　

　　电泳的支持物凝胶一般制备在玻璃管中或玻璃板上，所用玻璃管一般为8梍12cm长，内径5梍8mm。进行电泳的电泳槽分上槽和下槽，两个相互分离的部分，各装有电极，通过玻璃管中的凝胶，使它们连成导电的整体（图42）。电泳时带有电荷的分子在电场作用下发生移动，移动的速度依赖于电场的强度、分子的净电荷以及分子的大小和形状，同时也取决于介质的离子强度、粘度和温度。由于PAA凝胶具有三维网状结构，能起分子筛效应，用它作为电泳支持物，把分子筛效应和电荷效应结合起来，达到了很好的分离效果，而且方法也简单、快速，是植物生理生化研究中常用的方法。_

 

Ⅰ．阳向极PAGE

 

　　用于分离酸性或中性蛋白质，电泳时蛋白质向阳极泳动。

 

仪器药品

 

　　稳压稳流电泳仪　　　 真空泵

　　真空干燥器 　　　　　电泳槽

　　微量加样器　　　　　 6号长注射针

　　注射器

　　试剂贮备液：

　　A．1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸馏水配成100ml，pH8.9。

　　B．1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml，pH6.7。

　　C．Acr28g，Bis0.735g，加蒸馏水配成100ml。

　　D．Acr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。

　　E．核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。

　　F．蔗糖40g，加蒸馏水配成100ml。

　　G．电极缓冲液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸馏水配成1000ml，pH8.3，用时稀释10倍。

　　H．过硫酸铵0.14g，加蒸馏水配成100ml。

　　I．溴酚蓝1mg溶于100ml蒸馏水中。

　　J．脱色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml。

　　K．蛋白质染色液：考玛斯蓝G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸馏水80ml，溶解后混合之。

　　L．过氧化物酶染色液：

　　染色液甲：联苯胺─抗坏血酸染色液，染色数分钟。

　　抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液20ml（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中，再加蒸馏水72ml），0.6%过氧化氢20ml，蒸馏水60ml。

　　染色液乙：联茴香胺染色液，染色至少1小时。

　　(1)0.1mol/L醋酸缓冲液，pH5.5（0.82g醋酸钠溶于80ml蒸馏水中，用醋酸调节至pH5.5，定容至100ml）。

　　(2)30%H2O20.25ml溶于50ml蒸馏水中，用时新鲜配制。

　　(3)邻联茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶于100ml醋酸缓冲液(1)中。

　　用时取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。

 

操作步骤

 

　　1．凝胶的制备

　　(1)分离胶：按A∶C∶H∶水=1∶2∶4∶1的比例，先将贮备液A，C和水放在一小烧杯中，贮备液H放在另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15分钟，取出将H并入，用玻棒轻轻搅动使之混合，立即注于干洁的玻管中。玻管的底部要密封，并垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要进入气泡。胶液注到离管口2cm处，立即在其表面覆盖少量蒸馏水，静置1小时左右，当见到水层下面有一清晰的界面时，则表明胶已聚合凝固，用吸水纸小心吸去上面水层。

　　(2)浓缩胶：按B∶D∶E∶F=1∶2∶1∶4的比例，同上法制备浓缩胶，加到已凝固的分离胶上面，高度约1cm，同样覆盖一层蒸馏水。置于日光灯下照光约1小时，直至凝固，吸去上面水层，待用。

　　2．加样及电泳

　　(1)取贮备缓冲液G─200ml，加预冷的蒸馏水1800ml，稀释10倍，取1000ml倒在电泳槽的下槽。

　　(2)除去凝胶管底部的密封，插入电泳槽中。

　　(3)取实验89中经硫酸铵分级沉淀的过氧化物酶透析液，用取样器于每管的胶面上加入样品100μl（含蛋白质50─100μg，如浓度过稀，可把酶液装在透析袋中，用蔗糖浓缩），然后用稀释的溶液G，小心地将每管充满。

　　(4)在电泳槽的上槽同样倒入稀释10倍的缓冲液G，缓冲液中加入1ml溴酚蓝溶液I。

　　(5)连接好导线，将上槽接到电泳仪的（─）极，下槽接（ ）极。开启电泳仪电源，调节输出电流，使每管电流强度为2mA，通电15分钟。然后增加电流使每管达5mA，大约经过2─3小时，直至管中的染料迁移到离管底5mm左右，停止通电，结束电泳，取下胶管。

　　3．脱胶及显色

　　(1)取50ml注射器灌满水，配上6号长针头，将针头插入胶与管壁之间，一边注水一边将针头向前推进，直至把凝胶从管中脱出。如果凝胶还不能脱出，可用洗耳球从管口上端压入空气，促使凝胶自管内脱出。

　　(2)将胶分成二组，一组用考玛斯蓝G─250进行蛋白质染色；另一组置于过氧化物酶染色液甲或乙中进行染色。

　　(3)取出经过染色的凝胶，用水冲洗数次，然后置于脱色溶液J中进行脱色，除去凝胶的本底颜色，使色带更为清晰。

　　(4)绘图比较蛋白质带和过氧化物酶活性带。

 

Ⅱ．阴极向PAGE

 

　　用于分离碱性蛋白质，电泳时蛋白质向阴极泳动。

　　试剂贮备液：

　　A．KOH2.7g，冰醋酸17.2ml，TEMED4.0ml，加蒸馏水配成100ml。

　　B．KOH2.7g，冰醋酸2.87ml，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml。

　　C．Acr30g，Bis0.8g，加蒸馏水配成100ml。

　　D．Acr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。

　　E．核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。

　　G．电极缓冲液：31.2gβ—丙氨酸，冰醋酸8ml，加蒸馏水配成1000ml，pH4.5。

　　H．过硫酸铵0.28g，加蒸馏水配成100ml。

　　I．0.1%碱性品红（Basic fuchsin）水溶液，用作电泳指示染料。

　　J．甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml，用于脱色。

　　分离胶：A∶C∶H∶水=1∶2∶4∶1。

　　浓缩胶：B∶D∶E∶水=1∶2∶1∶4。

　　电极缓冲液G不必稀释，直接加在上、下槽中，注意上槽应接电泳仪（ ）极，下槽接（─）极，以碱性品红染料作指示剂，其他所有操作同上。

　　注：本实验所用药品Acr，联苯胺，联茴香胺对人体有毒性，防止接触皮肤及吸入。