实时定量PCR荧光材料新进展

为了满足实时PCR更高敏感性要求，各试剂公司都致力于开发新型的化学发光材料，目前作为商业用途的这些化学物质都能适用于上述的各种仪器。它们主要有以下几种：
1. 水解探针或Taqman探针：这种探针用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’à3’活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM（6－羧基荧光素）,TET（四氯－6－羧基荧光素）,JOE（2，7－二甲基－4，5－二氯－6－羧基荧光素），HEX（六氯－6－甲基荧光素）或VIC，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明)或DABCYL（4-（4’-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸）。相较之于TAMRA，使用DABCYL可以更有效的减少自发荧光信号[6]。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。

2. 分子信标: 是一种单链DNA形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一端有一淬灭基团[18]，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近，两者之间发生荧光信号能量共振转移（fluorescent resonance energy transfer FRET），当热循环温度达到分子beacon的解链温度时，其构象发生改变，能与模板结合而完全伸展成线性分子，使得FRET消失，报告基团发出荧光信号。分子信标特别适用于检测点突变，这能区分只有一个核苷酸差异的不同DNA序列，而且其敏感性要远比同等长度的寡核苷酸探针高，分子beacon已被用于
突变检测、病原体定量、病毒检测和胚胎的性别判断，它同时出用于多重PCR检测逆转录病毒。

3. scorpions: 它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探针，但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不能发射荧光。在反应的变性阶段，探针的发夹结构会解开，构象发生改变，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。同Taqman探针和分子beacon相比，scorpion能更快地发射出荧光且信号更为强烈[31]，其特异性也很高，因为只有在反应体系中存在特异的目的基因，探针-引物才会与之相结合。Scorpion是一种较新的荧光材料，具有良好的应用前景。

4. 杂交探针：该材料使用四个寡聚核苷酸分子，两个引物与两个探针，杂交探针分别单标，一个携带荧光供体基团，一个携带荧光受体基团，当这两个探针杂交到目的基因上时，能形成首尾相连的结构使两个荧光基团相互靠近，发生FRET。受体基团能转移能量，使得供体基团在不同波长条件下被激发，发射出的荧光量直接与目的基因的产量成相关关系。这一方法已被Roche公司生产的Lightcycler所应用，进行病原体检测、病毒荷载量的测定等领域。

5. SYBR Green I: 这是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中，从经济角度考虑，它也比其它的探针的价格要便宜得多，但由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素，一方面可以通过Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等热循环仪内设定的程序过对扩增曲线进行分析，以区分由PCR产物和本底造成的荧光信号，另一方面就是选择良好的引物和探针并优化反应条件以消除非特异性影响。