荧光PCR/实时定量PCR技术应用简介

一．荧光PCR原理

 

1．荧光共振能量传递 (FRET)

某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。

2．荧光化学：

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

二．实时荧光PCR技术靶基因的确定及引物和探针的设计原则

1．靶基因的确定：选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性(漏检)。

2．检测片段的确定：选择检测组内的保守 (突变少)（避免假阴性）、组间特异的序列 (突变多)（避免假阳性）作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。

3．引物：长度17-25bp;GC含量30-80%;退火温度(Tm值)58-60℃；避免稳定的引物二聚体（特别是多联检测）及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出现连续的G，3’端避免G或C，最后5个碱基内避免两个以上的G或C。

4．探针：长度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值为68-70℃；避免稳定的二聚体及发夹结构 (自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置尽量靠近上游引物；选择波长差异较大（多联检测）或Fam(单联检测）的荧光标记。

三.特点和优势

1．特异性强：引物和探针的“双保险”，避免检测的假阳性。

2．灵敏度高：分析PCR产物的对数期，自动化仪器收集荧光信号，避免了许多人为因素干扰。

3．避免污染：全封闭反应，无须PCR后处理。

4．实现定量：运用标准品获得标准曲线，结合Ct值进行准确定量。

5．高效低耗：可实现一管多检。

6．操作简便：在线式实时监测扩增结果，不必接触有害物质。

7．快速：反应时间<1.5小时。

四．实用意义：

1．提高检测效率，缩短检测周期，提高通关速度；

2．降低检测成本，提高经济与社会效益。