地高辛-碱性磷酸酶（Dig -AKP）标记DNA探针

　　1．组织前处理

　　（1）固定：组织以10%中性福尔马林液或Bouins液固定，常规石蜡包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更紧贴玻片。
　　（2）脱蜡：二甲苯10min ×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/l MgCl2,pH7.3～7.4）10min×2。入0.2n HCl 20min以进一步去除蛋白。
　　（3）50℃2×SSC，含5mmol/l EDTA溶液中30min。
　　（4）蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中，）37℃20～25min。
　　（5）0.2mol/l 甘氨酸液：室温10min，中止蛋白酶反应。
　　（6）4%多聚甲醛（PBS新鲜配制）：室温20min。
　　（7）PBS/5mmol/l MgCl2漂洗10min×2。
　　（8）脱水，自低浓度到高浓度，无水乙醇各3min，空气干燥。

　　2．预杂交封闭非特异性杂交位点，20μl/每张切片，42℃水浴半小时。

　　3．杂交10～20μl/每张切片，加盖硅化盖玻片，将切片置于95℃min，使探针及病毒DNA变性，然后迅速置于冰上1min（也有报告用乙醇使之冷却的），然后将切片置于盛有2×SSC湿盒内，42℃过夜（16～18h）。

　　4．杂交后漂洗

　　（1）2×SSC液内振动移除盖片。
　　（2）2×SSc 55℃10min×2。
　　（3）0.5×SSc 55℃5min×2。
　　（4）缓冲液II（含0.5%封阻试剂，用缓冲液I溶解）37℃30min。
　　（5）缓冲液I（10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5）15min，室温。
　　（6）酶标地高辛抗体（1：5000，应用缓冲液I稀释）37℃30min。
　　（7）缓冲液i 15min×2室温。
　　（8）缓冲液III（100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5）室温2min。

　　5．显色

　　（1）显色液配制：缓冲液III：1ml中加入4.5μl四氮唑蓝（NBT），3.5μl X-磷酸盐（5-溴-4-氯-3吲哚磷酸盐（BCIP配成））。30μl/每张切片，置暗处显色30min到2h。定时抽查切片，镜检其显色情况。
　　（2）缓冲IV（10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0）10min终止反应，甲绿复染5min，二甲苯透明，DPX封固，镜检。