Blastn之引物序列验证篇

先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的 mRNA 序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠 c-jun mRNA 序列的 ACCESSION NUMBER ，在 PubMed 中的“ Nucleotide ”中用此 ACCESSION NUMBER 就能找到序列。可以利用这个 ACCESSION NUMBER 在 PubMed 中的“ Nucleotide ”中搜索到序列后，点击右边的“ Links ”，再点击里面的“ Related Sequences ”就能找到所有的大鼠 c-jun mRNA 序列及其他物种的一些 c-jun mRNA 序列。

文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件分析引物比较好后再采用。通过 BLAST 验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及 PCR 产物的大小等。

如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用 Blast 的“ Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) ”或“ Search for short, nearly exact matches ”搜索，具体方法为：

1. 打开 Blast ，点击“ Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) ”或“ Search for short, nearly exact matches”

2. 等新页面完全显示后，将引物序列直接 copy 到“ Search ”框（没有必要将下游引物序列转换成其互补链），下面 3 种方法都可以（我觉得这 3 种方法的搜索结果没有什么区别，没仔细比较过哦！）
　（１）直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面
　（２）直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面
　（３）直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列

注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为 19bp 、下游引物为 18bp ，这在查看 Blast 结果时有用。

3. 点击“ BLAST ！”，新页面完全出来以后，点击“ Format ！”。

4. 结果完全出来后，查找有没有和 1-19 、 20-37 同时完全匹配的基因，其他的就不用考虑了。当然，如果下游引物序列所对应的基因片段的 3' 端正好和上游引物序列的 3' 端的 1 或 2 个碱基互补，那就可能是 19-37 或 18-37 。

如果有，那你的引物序列就是正确的。从文献上查的引物，除了要用 Blast 验证其序列是否正确外，还是应该用软件分析分析到底引物好不好。