一步步教你利用Blast分析验证引物序列

互联网2013-09-06

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引物设计完成之后，需要用软件进行分析，找到最佳的引物对，采用Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。

先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mrna 序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links”，再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种的一些c-jun mRNA序列。

文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件分析引物比较好后再采用。通过BLAST验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR 产物的大小等。

如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：

1. 打开Blast，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”

2. 等新页面完全显示后，将引物序列直接copy到“Search”框（没有必要将下游引物序列转换成其互补链），下面3种方法都可以（我觉得这3种方法的搜索结果没有什么区别，没仔细比较过哦！）
　（１）直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面
　（２）直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面
　（３）直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列

注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为19bp、下游引物为18bp，这在查看Blast结果时有用。

3. 点击“BLAST！”，新页面完全出来以后，点击“Format！”。

4. 结果完全出来后，查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因，其他的就不用考虑了。当然，如果下游引物序列所对应的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2个碱基互补，那就可能是19-37或18-37。

如果有，那你的引物序列就是正确的。从文献上查的引物，除了要用Blast验证其序列是否正确外，还是应该用软件分析分析到底引物好不好。

实例

1、进入网页：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

2、点击Search for short, nearly exact matches

3、在search栏中输入引物系列：

注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’

(1)输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。

这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。

(2)简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。

A、输入上游引物空格输入下游引物

B、输入上游引物回车输入下游引物

4、在options for advanced blasting中：

select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】

Expect后面的数字改为10

5、在format中：

select from 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】

Expect后面的数字填上0 10

6、点击网页中最下面的“BLAST!”

7、出现新的网页，点击Format!

8、等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。

(1)图形格式：

图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分

图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补

图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配

通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。

(2)结果信息概要：

从左到右分别为：

A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息

B、系列的简单描述

C、高比值片段对(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式=匹配的碱基×2+0.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。

D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了

E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：

U代表：Unigene数据库

E代表：GEO profiles数据库

G代表：Gene数据库

(3)结果详细信息：

①圈出来的部分代表序列的信息

②第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：

共有21个碱基匹配，得分42.1分【21×2+0.1=42.1】，E值为0.020

上游引物与序列的2143～2163位点匹配

③第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况：

共有20个碱基匹配，得分40.1分【20×2+0.1=40.1】，E值为0.077。

下游引物与该序列的29360～29379位点互补

注意点：

①上游引物为20个碱基，为什么会变成21个碱基呢?这是因为下游引物的第一个碱基为T，刚好与系列的2163位点的T匹配，因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。同理，上游引物的最后一个碱基为G，被当成了下游引物了。通过寻找有没有与1～20位点、20～40位点完全匹配的序列，就可以避免这个因素的干扰了。

②为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种?

A、为同一个基因来源的不同的mRNA片段

B、为该基因的DNA系列

C、为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。

结果判断：

①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用

②检测该引物是否存有同源序列相匹配，造成PCR反应的非特异扩增。如果上游引物和下游引物都找到的相同的基因，并且分数非常高。这种结果表明所设计的引物序列特异性不高，最好重新设计引物，否则会得到非特异扩增的PCR产物。