DNA碱基序列确定法 DNA sequencing

有Maxam-Gilbert法及 Sanger法（又称双脱氧法， Dideoxy法）。前一方法（ Maxam-Gilbert′ ssequencing method）是 1977年发表的方法，又称化学分析法。即把用限制酶切断所得的 DNA片段的 5′末端，再用 32 P标记〔通过使用（ r32P） ATP和多聚核苷酸激酶〕。然后或将双链分离，或用其它限制酶切断，制出只有双链中的一个链的末端被标记。将这样的 DNA链，通过用碱基特异的化学分解反应，并部分地分解，例如应用与鸟苷残基特异反应进行部分分解，得到从用 32 P标识的 5′末端各鸟苷残基部位分解下来的片段之混合物。关于腺苷、胞苷以及胸苷也可这样得到部分分解产物。将这些部分分解产物并列起来，由聚丙烯酰胺凝胶电泳法根据链长进行分离。电泳后，用放射自显影法将在 5末端含有 32P的 DNA片段，通过梯状带进行测定。因从 5′末端开始各核苷酸在出现的位置上显出带，所以根据变移率的顺序将带记录，则可了解碱基序列。也有不标记 5’末端， 而是标记 3′末端来作此实验的。又 Sanger法（ Sa-nger′ s sequencing method， dideoxy method）因为是利用 DNA聚合酶的修复反应，所以也称为酶法。此法的原理发表于 1975年，但后来曾作了一些改良，从而才形成现在的方法。首先向单链 DNA加入作为引物的短的互补链，制成异源双链，加入 DNA聚合酶（参见科恩伯格酶）和四种脱氧核苷三磷酸，使其从弓吁的 3′末端开始合成 DNA，此时加入少量的 DNA延长抑制剂二脱氧核苷三磷酸时，则在吸入此物质的地方 DNA链的延长便终止。因为二脱氧核苷三磷酸是无规则地被吸收，所以结果从引物形成各种长短的 DNA链。将由于个别加入四种二脱氧核苷酸而合成的反应产物，通过与前述 Maxam－ Gilbert法同样的凝胶电泳法可分析出碱基序列。用这些方法时，在一个凝胶板上可分析多少碱基序列？这主要依赖于凝胶电泳的分离能力，但在标准条件下可以确定出近 200个碱基序列。