甲基化特异性 PCR 确定 DNA 甲基化的模式

1.把样品 DNA(达 1ug) 稀释到 1.5 ml 微离心管中的 50ul 水中。如果使用的 DNA 更少（包括从石蜡包被的样品提取的 DAN)，预期的产量少（如很微弱的条带）或者增加循环次数提高产量。准备好阳性和阴性对照 DNA 的稀释液和样品平行进行以下步骤。

2.加入 5.5ul 2mol/L NaOH。37°C，孵育 lOmin。加入 3u1 新鲜配置的 l0mmol/L 对苯二酚和 520ul 新鲜配置的 3mol/L 重亚硫酸钠。混勻并加入足量的矿物油（约 50ul) 用以覆盖水相。50°C 孵育 16 h。

3.除去油。加入 1ml DNA Wizard 试剂，把混合物加到试剂盒带有的 niiniprep 柱。真空处理。用 2ml 80% 异丙醇洗。把柱子置于一个干净的 1.5 ml 管，加入 50ul 60~70°C 的水。离心管子和柱子 1min。每管加入 55ul 3mol/L NaoH，室温孵育 5 min。

4.加入 1ul 10mg/ml 糖苷配糖基，然后加入 17ul 10mol/L 乙酸胺和 3 体积 100% 的冰冻乙醇。-20°C，沉淀 DNA 几小时或过夜，离心 20 mm，去上清，用冰冻的 70% 的乙醇清洗，加入 20~30 ul 水溶解。处理单链 DNA 要像处理 RNA—样（冷冻，尽量减小反复冻融，可能的话保存在-70℃。

5.进行甲基化和非甲基化反映所要分析的样品的数目，包括阳性和非 DNA 对照。准备好甲基化和非甲基化 PCR 反应（50ul) 的主要反应混合物，包括：

5ul 10XPCR 扩增缓冲液；

2.5ul 25 mmol/L 4dNTP 混合物；

1ul 300ng/ul 的有义引物；

1ul 300ng/ul 的反义引物；

28.5ul 水。

混匀。

6.取 3.8ul 主要反应混合物到标记的 PCR 管。每管加人 2ul 重亚硫酸钠修改的 DNA 模板（第 4 步）。如果需要，每管加入 25~50ul 的矿物油，放入热循环仪。PCR 从 95°C 变性 5 min 开始。

7.对每个样品，取 1.25U Taq DNA 聚合酶稀释到 10ul 无菌蒸馏水中。通过油层加入到 40ul 混合物中，并轻轻地吹打。也可以选择用其他形式热启动 PCR。按如下所示继续 PCR 扩增。

35 个循环：

30s 95℃ (变性)

30s 不同的引物温度不一样 (退火)

30s 72℃ (延伸)

最终步骤：
4min 72℃ (延伸)

4°C 保存反应产物直至分析。

8.准备 6%~8%(m/V) 非变性聚丙烯酰胺胶，用 1 X TBE 缓冲液作溶剂（单元 7.2)。10V/cm 跑垂直胶 1?2 h，每个样品的反应产物在相邻的泳道，这样可以对甲基化和非甲基化位点之间进行直接的比较。包括阳性和阴性对照。

9.用溴化乙键染胶，在 UVtransilluminator 观察并对胶进行拍照（附录 3G)。一般情况下，产物的范围是 80~200bp。