细胞膜蛋白的分离
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实验试剂
缓冲液A：1mM KCl，5mM NaCl，3mM MgCl2 ，50mM Hepes，1mM DTT，0.5ug/ml Leupeptin，20uM PMSF(PH=7.4)
缓冲液B：1mM KCl，5mM NaCl，3mM MgCl2 ，50mM Hepes，1mM DTT，0.5ug/ml Leupeptin，20uM PMSF(PH=7.4)，1mM EGTA
缓冲液C：0.5ug/ml Leupeptin，20uM PMSF，50mMTris-Cl (PH=7.0)
2. 方法二
2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7.5）、蛋白酶抑制剂缓冲液A（含0.5mol/LNaCl的RIPA 缓冲液）
缓冲液C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
实验步骤
1. 方法一
1) 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2) 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3) 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4) 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
2. 方法二
1) 细胞放在冰上，去除上清，用pH7.4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次。
2) 加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min。
3) 刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心。
4) 溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min。
5) 收集水相留作分析。
6) 用500ul冰冷的缓冲液C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心。
7) 按步骤8再次抽提去污剂相，用缓冲液 C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积。
8) 用等量的缓冲液A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验。
