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弹性蛋白的分离

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弹性蛋白的溶解性极差,一般采取的技术路线是使用多种手段将非弹性蛋白去除,以获得不溶性的弹性蛋白。
操作方法:
1.  将富含弹性蛋白的组织(如器官、胸膜、主动脉等)上附着的结缔组织仔细去除。
2.  用打碎机将组织在4℃、50%吡啶水溶液中打碎,3,000g×10min离心,弃上清,取沉淀。
3.  沉淀用冷 蒸馏 水离心洗涤,直至细胞无吡啶气味为止。
4.  真空干燥后,浸入液氮中,稍后取出研磨成粉,将其悬浮于2mol/L CaCl 2 溶液中,4℃持续搅拌24h。
5.  离心弃上清,沉淀用冷 蒸馏 水离心洗涤,无水乙醇作用20min,2 # 砂芯漏斗滤去抽提液,沉淀2:1(V/V)氯仿­­­-甲醇浸泡20min,再经2 # 砂芯漏斗滤去抽提液。沉淀用乙醚冲洗后,冷冻干燥。
6. 冷冻干燥后的沉淀,用胶原酶消化液悬浮,加入纯化的胶原酶(组织:酶=50:1W/W),37℃,消化过夜。
7.  离心弃上清,沉淀重复6、7步骤,离心得到的沉淀用冷蒸馏水洗涤。
8.  将沉淀移入具塞玻璃烧瓶,加入含有5mol/L盐酸胍、0.05mol/L二硫赤藓糖醇、
2.6mmol/L EDTA 的0.1mol/L Tris 缓冲液(pH8.5)中,通氮气,加塞,37℃过夜。离心弃上清,沉淀用蒸馏水洗涤2次。
9.  将沉淀再移入具塞玻璃烧瓶中,加入含有6mol/L尿素,34.7mmol/L SDS及含有0.05mol/L Tris 缓冲液(pH7.7)中,通氮,加塞,室温过夜,离心,弃上清。
10.重复9步,2次。离心取沉淀,蒸馏水透析至检测不到 SDS 为止。沉淀冷冻干燥得弹性蛋白制品。
 
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