双向电泳的实验相关试剂配制

互联网2013-09-06

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1． Bradford 工作液 95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效） 2．裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris―base 40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate） 3. 水化液储液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% Tris―base 40 mM 4. 分离胶buffer (pH8.8) 250ml SDS 0.4% 1g Tris―HCl 1.5M 45.4275g 5. 浓缩胶buffer (pH6.8) 100ml SDS 0.4% 0.4g Tris―HCl 0.5M 6.07g 6. 凝胶储存液（30%的丙烯酰胺） 250ml Acr 29.2% 73g Bis 0.8% 2g 7. 电极缓冲液（跑一次要配制2500ml） 甘氨酸 43.2g 36g Tris 9g 或 7.5g SDS 3g 2.5g 超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml 8． 0.5M Tris ―HCl pH 6.8储液 6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml，3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml 9．平衡液储液 脲（即尿素） 36g 甘油 30% 30ml SDS 1% 1g 0.5M Tris―HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至100ml 10. 平衡液A（一根胶条） DTT 20mg 平衡液储液 10ml 11．平衡液B（一根胶条） 碘乙酰氨 300mg 平衡液储液 10ml 0.05%溴酚兰 15ul (平衡液A、B均需临时配制) 12．0.5%琼脂糖10ml 琼脂糖 0.05g 电极缓冲液 10ml 溴酚兰 25ul 补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4OC备用。 C．药品 CHAPS 兼性离子去垢剂去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用， SDS 离子型去垢剂提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出 尿素离液剂可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质 硫脲离液剂变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可 以大大增加蛋白质的溶解性 DTT 还原剂断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度，由于它pKa在8左右，因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀 BSA Bradford中制作标准曲线用 无水乙醇和磷酸一起，提供Bradford中的环境 磷酸提供Bradford中的酸性环境 Tris 构成缓冲液的成分，可用于抗衡pH的变化 IPG buffer 覆盖液即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。 丙烯酰胺（Acr）以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂， 甲叉二丙烯酰胺（Bis）在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维网状结构 琼脂糖 溴酚兰指示剂作用 碘乙酰氨（IAA）平衡液B中使用，中和A液中的DTT 正丁醇比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶 甘油无机盐的良好溶剂，热稳定性好 Marker 考马斯亮兰G250（Bradford法用）考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465~595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量 甘氨酸与Tris构成缓冲系统 AgNO3 EDTA 金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程