双向电泳实验过程及相关溶液配置

一、实验原理：

2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、实验步骤：

1.样品的溶解

取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300μl裂解液(1mg蛋白:100μl裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70μl，—80℃保存。

2.Bradford法测蛋白含量

取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的BSA溶解液，另2管中分别加入2μl的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80μl），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：

编号 蛋白量（ul）Buffer(ul)Bradford(ml)OD595值

1 0 80 4 0

2 5 75 4 0.024

3 10 70 4 0.061

4 15 65 4 0.091

5 20 60 4 0.116

Bt4 2 78 4 0.079

Bt4 4 76 4

转Bt4 2 78 4 0.075

转Bt4 4 76 4

标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。a、b通过作图输入数据可知

相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得

OD值测量过程：

比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。

3.双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）

3.1 水化液的制备

称取2.0mg 的DTT，用700μl水化液储液溶解后,加入8μl 0.05% 的溴酚兰，3.5μl（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。

在含300μg 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340μl，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。

3.2 点样，上胶

分两次吸取样品，每次170μl,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。

注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。

3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20℃）

S1 (30v,12hr,360vhs,step)

S2 (500v,1hr,500vhs,step)

S3 (1000v,1hr,1000vhs,step)

S4 (8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)

S5 (8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时

其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦