pull down相关实验

净化体系，考虑阴性区可能有污染杂质

影响GST pull down实验结果的因素有:1、 载体选择2、 诱导温度3、 诱导时间4、诱导物浓度5、GST 标签的影响。以上因素改变均会影响实验。

在GST pull down实验中，阴性对照通常是使用GST标记的质粒或纯化的GST蛋白，以确认目标蛋白是否真的与GST蛋白相互作用。如果阴性对照有带，可能是由于实验操作或实验条件的问题所导致的。以下是几个可能导致阴性对照有带的原因及相应的解决方法：

污染问题：可能是样品污染引起的，比如说样品与试剂接触时间过长、操作过程中受到污染等等。解决方法是在操作过程中注意实验操作的干净、卫生，避免污染，并进行必要的质量控制。

GST蛋白质的纯度不够高：GST蛋白质的纯度对阴性对照的结果影响较大，如果GST蛋白质的纯度不够高，可能会产生一些非特异性的结合，从而导致阴性对照有带。解决方法是使用高质量的GST蛋白，或者对纯化过程进行优化。

GST蛋白固定效果不好：如果GST蛋白的固定效果不好，可能会导致GST蛋白在阴性对照中非特异性结合。解决方法是在实验前对GST蛋白的固定效果进行优化，或者更换其它适合的固定方法。

试剂或溶液问题：可能是试剂或溶液的pH值、温度或者其他因素不合适，导致GST蛋白与阴性对照非特异性结合。解决方法是在实验前对试剂和溶液的质量进行评估，确保其符合实验要求。

综上所述，阴性对照有带的原因可能有多种，需要针对具体实验进行分析。在进行实验前，可以考虑对实验条件和实验步骤进行优化和调整，加强质量控制，以确保实验结果的准确性和可靠性。

两种并不互作的DNA结合蛋白可能会因为DNA的存在而出现相互作用的假阳性结果，因此，在进行GST pull-down实验时，加入核酸酶的步骤十分必要。

影响实验结果的因素有很多可以从如下几点进行分析和解决：

（1）表达载体的选择是一个重要因素。所以，在进行载体选择时，要考虑到载体表达蛋白量的高低、是否能被诱导剂诱导表达等因素，一般常用的载体是pGEX-4T-1。

（2）在进行蛋白的诱导表达时，可溶性表达温度也是至关重要的一个因素。当温度过高，载体就容易形成包涵体，若复性不顺利，蛋白没有活性，会影响后续的实验。建议进行一个诱导温度的摸索，建议诱导温度在16℃~25℃。

（3）诱导时间也非常重要，细菌在对数生长期时，是最佳的添加诱导剂诱导表达的时间。诱导时间过长的话，诱导剂不会被细菌代谢，会一直进行蛋白的诱导表达过程。诱导剂的浓度、诱导的时间、培养的温度，这些因素都是综合影响着蛋白的表达结果。