大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）

 

大肠杆菌质粒 DNA 的提取（碱裂解法）

此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。

1 ).    取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；

2 ).    将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡；

3 ).    加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；

4 ).    加入150 µl预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H₂ O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟；

5 ).    在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；

6 ).    用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；

7 ).    小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；

8 ).    加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH₂ O溶解；

9 ).    用0.5µl的RNase 37℃温育5~10分钟；

10 ).     电泳鉴定。