PCR技术（八）：扩增较大片段DNA的PCR方法

一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：

　　通常所用的PCR方法都在两个方面 有局限，即目标产物精确程度 和合成片段的大小 。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶， 具有完整的3'外切酶校读活性（3'-editing-exonuclease） ，可以将每个循环中碱基的错配率由1undefined-4降到1undefined-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaq l (Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA聚合酶Ｉ Klenow片段）或AmpliTaq （全长的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。因而以往的PCR反应产物限制在5.0kb以内 。超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。即使将延伸时间定为30分钟（10倍于通常所需）亦无改进。

利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增

　　美国华盛顿大学医学院的Barnes WM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍 了延伸反应的正常进行，Pfu DNA聚合酶 虽然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。因此必需将Pfu DNA聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用Klentaq l等DNA聚合酶 ，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反应顺畅进行。实验证实，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小为27-33nt,即可使反应有效进行。当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。

控制脱嘌呤反应增强扩增效率

　　在PCR反应体系中某些成分耐热性较差，会影响反应效率 。DNA聚合酶的热稳定性一般都是较好的，可能是模板DNA 在温度较高的环境中某些位点发生脱嘌呤反应 从而阻碍反应的顺利进行。Lindahl和Nyberg 的研究结果显示：在70℃ pH7.4的条件下， 单链DNA脱嘌 呤反应的速度是双链DNA的４倍；100℃ pH7.0时，100kb的碱基中每分钟将有１个位点脱嘌呤。这一反应与缓冲体系中酸碱度的变化有关。人们注意到：三羟甲基氨基甲烷（Tris）的酸解离常数（pKa）会随温度升高而改变，平均每升高１℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃时pH8.55的PCR反应体系，到95℃热变性时，pH值将变为6.45，这就很可能诱导脱嘌呤反应。 为了解决这一问题，可以采取下列措施：

　　缩短热变性时间 ，Barnes等在扩增35kb的大片段时，变性条件为95℃5秒，取得满意结果；

　　尽可能使升温、 降温过程缩短 ，可选择使用导热性能优越的薄壁反应管及较为先进的扩增设备；

　　适当提高反应体系的pH值 ，反应最初应控制在pH8.8-9.2范围；

　　适当增加延伸时间 （可长至20分钟）。使用这种方法可以扩增最大为35kb的DNA片段，产物的准确性亦有充分保证，克服了以往基因克隆过程中出现的DNA分子内的碱基重排和可能的毒性危险等问题。