PCR技术（八）：扩增较大片段DNA的PCR方法

一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：

通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校读活性（3'-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由1undefined-4降到1undefined-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA聚合酶Ｉ Klenow片段）或AmpliTaq（全长的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。因而以往的PCR反应产物限制在5.0kb以内。超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。即使将延伸时间定为30分钟（10倍于通常所需）亦无改进。

利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增

美国华盛顿大学医学院的Barnes WM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，Pfu DNA聚合酶虽然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。因此必需将Pfu DNA聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反应顺畅进行。实验证实，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小为27-33nt,即可使反应有效进行。当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。

控制脱嘌呤反应增强扩增效率

在PCR反应体系中某些成分耐热性较差，会影响反应效率。DNA聚合酶的热稳定性一般都是较好的，可能是模板DNA在温度较高的环境中某些位点发生脱嘌呤反应从而阻碍反应的顺利进行。Lindahl和Nyberg的研究结果显示：在70℃ pH7.4的条件下， 单链DNA脱嘌 呤反应的速度是双链DNA的４倍；100℃ pH7.0时，100kb的碱基中每分钟将有１个位点脱嘌呤。这一反应与缓冲体系中酸碱度的变化有关。人们注意到：三羟甲基氨基甲烷（Tris）的酸解离常数（pKa）会随温度升高而改变，平均每升高１℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃时pH8.55的PCR反应体系，到95℃热变性时，pH值将变为6.45，这就很可能诱导脱嘌呤反应。 为了解决这一问题，可以采取下列措施：

缩短热变性时间，Barnes等在扩增35kb的大片段时，变性条件为95℃5秒，取得满意结果；

尽可能使升温、 降温过程缩短，可选择使用导热性能优越的薄壁反应管及较为先进的扩增设备；

适当提高反应体系的pH值，反应最初应控制在pH8.8-9.2范围；

适当增加延伸时间（可长至20分钟）。使用这种方法可以扩增最大为35kb的DNA片段，产物的准确性亦有充分保证，克服了以往基因克隆过程中出现的DNA分子内的碱基重排和可能的毒性危险等问题。