HRP标记抗体的方法
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酶与抗体交联的方法有许多种 , 根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备 HRP 结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。
戊二醛二步法
1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶 - 戊二醛 - 免疫球蛋白结合物。
2. 标记步骤：
(1) 称取 HRP25mg 溶于 1.25 ％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
(2) 反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在 1ml ／ 1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于 5ml ，则以 PEG 浓缩至 5ml 。放置 25ml 小烧杯中，缓慢搅拌。
(3) 将待标记的抗体 12.5mg 用生理盐水稀释至 5ml ，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25ml ，继续搅拌 3? 小时。
(5) 加 0.2M 赖氨酸 0.25ml ，混匀后，置室温 2 小时。
(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4 ℃ 1 小时。
(7) 3000rpm 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4 的 PBS 中。
(8) 将上述溶液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析，去除铵离子后 ( 用萘氏试剂检测 ) ， 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3. 结果判定：
(1) 定性及效价滴定：用特异性抗原 ( 或抗体 ) 同酶标记抗体 ( 或抗免疫球蛋白抗体 ) 作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接 ELISA 法 ( 或在正式实验系统里 ) 对酶结合物进行滴定 ( 见本节 ( 三 ) 工作浓度的选择 ) 。
(2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定 ( 光程 1cm) 。
酶量 (mg ／ ml) ＝ OD403nm × 0.4
IgG 量 (mg ／ ml) ＝ OD280nm-OD403nm × 0.42) × 0.94 × 0.62
酶量 (mg ／ ml) IgG 量 (mg ／ ml) 酶量
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
40,000 160,000 IgG 量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有 2 ～ 4 ％的酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材：
(1) 0.1M PH6.8 磷酸缓冲盐水 (PBS) ：取 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml ， NaCl1.8 克，加蒸馏水至 200ml 。
(2) 1.25 ％戊二醛液：取 25 ％戊二醛 50ml 与 PH6.8 的 PBS1ml 混合。
(3) 1M PH9.5 碳酸盐缓冲液：取 1M 碳酸钠 3ml 与 1M 碳酸氢钠 7ml 混合。
(4) 0.2M 赖氨酸溶液：称赖氨酸 29.2mg 溶于 0.01M PH9.5 碳酸缓冲液 1ml 中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。
(6) PH7.8 饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
(7) 萘氏试剂及聚乙二醇 (PEG ， MW2000) 。
(8) 纯化的特异性抗体或抗 Ig 抗体。
(9) HRP(RZ>3.0) 。
(10) Sephadex G-25 层析柱 (2cm × 50cm) 。
(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以 NaIO ４先将 HRP 表面的糖分子氧化成醛基，然后再与 Ig 上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近 70 ％的 HRP 和 Ig 结合， 99 ％的 Ig 与酶结合，酶与 Ig 的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
1. 原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭 HRP 上残留的α - 和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来 Wilson 等改用在低 PH 下使 NaIO ４氧化 HRP ，从而省去了二硝基氟苯封闭 HRP 步骤。 HRP 经 NaIO ４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用 NaBH ４ ( 或乙醇胺 ) 还原生成稳定的酶标记抗体。
2. 标记步骤 :
(1) 称取 5mgHRP 溶解于 1ml 蒸馏水中。
(2) 于上液中加入 0.2ml 新配的 0.1M NaIO ４溶液，室温下避光搅拌 20 分钟。
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4 ℃过夜。
(4) 加 20 μ l 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使以上醛化� RP 的 PH 升高到 9.0 ～ 9.5 ，然后立即加入 10mg IgG( 抗体，或 SPA5mg) 在 1ml 0.01M 碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌 2 小时。
(5) 加 0.1ml 新配的 4mg ／ ml NaBH ４液，混匀，再置 4 ℃ 2 小时。
(6) 将上述液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4 PBS 透析， 4 ℃过夜。
其余步骤 ( 纯化 ) 同戊二醛标记步骤的 (6) 、 (7) 、 (8) 。
3. 结果判定：
除标记物 IgG 量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG 量 (mg ／ ml) ＝ (OD280nm-OD403nm × 0.3) × 0.62
4. 试剂及器材 :
(1) 0.1M NaIO ４：称取 241mg 高碘酸钠 ( 广州化学试剂厂，批号 830602) 溶于蒸馏水 10ml 中。
(2) 1mM PH4.4 醋酸钠缓冲液 :
0.2M NaAc (1.361 克／ 50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml ／ 50ml) 6.3ml
加蒸馏水至 2,000ml 。
(3) 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液 :
Na ２ CO ３ 0.32 克
NaHCO ３ 0.586 克
加蒸馏水至 50ml
再用蒸馏水作 20 倍稀释，即成 0.01M PH9.5 的碳酸盐缓冲液。
(4) NaBH ４溶液 (4mg ／ ml):
临用时称取 NaBH ４ 4mg 溶于 1ml 蒸馏水中。
(5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。
( 三 ) 工作浓度的选择
在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
酶标记抗体的滴定方法是：将抗原 ( 或抗体 ) 物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体 ( 或抗 Ig 抗体 ) 与吸附在载体上的抗原 ( 或抗体 ) 起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
其步骤为：先将抗原 ( 或抗体 ) 用 0.05M PH9.6 包被缓冲液稀释为 10 μ g ／ ml 左右，于聚苯乙烯板孔内加 0.1ml ， 4 ℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤 3 次。酶标记抗体用 1 ％ BSA-PBS 液依次稀释成 1 ∶ 100 ， 1 ∶ 200 ， 1 ∶ 400 ， 1 ∶ 800 ， 1 ∶ 1600 …… ( 根据据抗体的滴度而定 ) ，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔 0.1ml ， 37 ℃孵育 1 小时后洗涤。然后加底物液，每孔 0.1ml ， 37 ℃ 10 ～ 30 分钟。以 2M H ２ SO ４ 0.05ml 终止反应。
结果判定主要以 ELISA 比色仪读取各孔 OD 值。并以 OD 为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得 OD 值为 1.0 左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见 ELISA 部分。
要说明的是，本法为 ELISA 直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立 ELISA 实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度 ( 可采用方阵法 ) ，以达到最适的实验条件。
( 四 ) 注意事项
1. 在具备高质量 HRP 的条件下，所要标记的抗体也要活性高 , 效价高 ( 最低 1 ∶ 16), 纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。
2. 所使用试剂的 PH 和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好 ( 或必需 ) 新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体 ( 杂质 ) 。否则，影响标记效果。
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在 25 ℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
4. 浓的标记物相当稳定，常加入 30 ～ 40 ％甘油于 -10 ℃下保存。 4 ℃可保存 1 ～ 2 年，但稀释成 1 ∶ 10 ，只能保存数周。已配制的使用液应在 12 小时内用完。切忌反复冻融。
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