HRP标记抗体的方法（戊二醛二步法与简易过碘酸钠法）

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酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

　　戊二醛二步法
　　1.　原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白 上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

　　2.　标记步骤：

　　(1)　称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

　　(2)　反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱 ，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。

　　(3)　将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

　　(4)　用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。

　　(5)　加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

　　(6)　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。

　　(7)　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS 中。

　　(8)　将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

　　3.　结果判定：

　　(1)　定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。

　　(2)　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。