HRP标记抗体的方法（戊二醛二步法和简易过碘酸钠法）

酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

一、戊二醛二步法

1. 原理：
戊二醛为一种双功能 试剂 ，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
2 　 试剂 及器材：
(1)　0.1MpH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49mL, 0.2M NaH2PO4 51mL，NaCl1.8克，加蒸馏水至200mL。
(2)　1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50mL与PH6.8的PBS1mL混合。
(3)　1MpH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3mL与1M碳酸氢钠7mL混合。
(4)　0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01MpH9.5碳酸缓冲液1mL中。
(5)　0.15MpH7.4 PBS及生理盐水。
(6)　PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
(7)　萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8)　纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
(9)　HRP(RZ>3.0)。
(10) SepHadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
(11) 搅拌器，分光光度计， 离心机 。
(12) 透析袋，大、小烧杯， 试管 ，吸管等。
3. 标记步骤：
(1)　称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
(2)　反应后的酶溶液经SepHadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1mL/1min，收集棕色流出液。如体积大于5mL，则以PEG浓缩至5mL。放置25mL小烧杯中，缓慢搅拌。
(3)　将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5mL，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)　用1MpH9.5碳酸缓冲液0.25mL，继续搅拌3h。
(5)　加0.2M赖氨酸0.25mL，混匀后，置室温2h。
(6)　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。
(7)　3000rpm离心0.5h，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。
(8)　将上述溶液装入透析袋中，对0.15MpH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
4. 结果判定：
(1)　定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定。
(2)　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
酶量(mg／mL)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg／mL)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg／mL)         IgG量(mg／mL )      酶量
克分子比值＝ ————————   ÷  ———————— ＝ ———— × 4
                 40000                160000             IgG量
(3)　本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4%的酶与蛋白质结合。