戊二醛二步法制备HRP结合物

　　 1. 　原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶 - 戊二醛 - 免疫球蛋白结合物。

　　 2. 　标记步骤：
　　 (1) 　称取 HRP25mg 溶于 1.25 ％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
　　 (2) 　反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在 1ml ／ 1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于 5ml ，则以 PEG 浓缩至 5ml 。放置 25ml 小烧杯中，缓慢搅拌。
　　 (3) 　将待标记的抗体 12.5mg 用生理盐水稀释至 5ml ，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
　　 (4) 　用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25ml ，继续搅拌 3? 小时。
　　 (5) 　加 0.2M 赖氨酸 0.25ml ，混匀后，置室温 2 小时。
　　 (6) 　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4 ℃ 1 小时。
　　 (7) 　 3000rpm 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4 的 PBS 中。
　　 (8) 　将上述溶液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析，去除铵离子后 ( 用萘氏试剂检测 ) ， 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

　　 3. 　结果判定：
　　 (1) 　定性及效价滴定：用特异性抗原 ( 或抗体 ) 同酶标记抗体 ( 或抗免疫球蛋白抗体 ) 作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接 ELISA 法 ( 或在正式实验系统里 ) 对酶结合物进行滴定 ( 见本节 ( 三 ) 工作浓度的选择 ) 。
　　 (2) 　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定 ( 光程 1cm) 。
　　酶量 (mg ／ ml) ＝ OD403nm × 0.4
　　 IgG 量 (mg ／ ml) ＝ OD280nm-OD403nm × 0.42) × 0.94 × 0.62

　　　　　　　　　酶量 (mg ／ ml) 　　 IgG 量 (mg ／ ml) 　　酶量
　　克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
　　　　　　　　　　 40,000 　　　　　　 160,000 　　　 IgG 量

　　　 (3) 　本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有 2 ～ 4 ％的酶与蛋白质结合。

 

　　 4. 　试剂及器材：
　　 (1) 　 0.1M PH6.8 磷酸缓冲盐水 (PBS) ：取 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml ， NaCl1.8 克，加蒸馏水至 200ml 。
　　 (2) 　 1.25 ％戊二醛液：取 25 ％戊二醛 50ml 与 PH6.8 的 PBS1ml 混合。
　　 (3) 　 1M PH9.5 碳酸盐缓冲液：取 1M 碳酸钠 3ml 与 1M 碳酸氢钠 7ml 混合。
　　 (4) 　 0.2M 赖氨酸溶液：称赖氨酸 29.2mg 溶于 0.01M PH9.5 碳酸缓冲液 1ml 中。
　　 (5) 　 0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。
　　 (6) 　 PH7.8 饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
　　 (7) 　萘氏试剂及聚乙二醇 (PEG ， MW2000) 。
　　 (8) 　纯化的特异性抗体或抗 Ig 抗体。
　　 (9) 　 HRP(RZ>3.0) 。
　　 (10) Sephadex G-25 层析柱 (2cm × 50cm) 。
　　 (11) 搅拌器，分光光度计，离心机。
　　 (12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。