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戊二醛二步法制备HRP结合物

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   <font>1.</font>  原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶 <font>-</font> 戊二醛 <font>-</font> 免疫球蛋白结合物。

   <font>2.</font>  标记步骤:
   <font>(1)</font>  称取 <font>HRP25mg</font> 溶于 <font>1.25</font> %戊二醛溶液中,于室温静置过夜。
   <font>(2)</font>  反应后的酶溶液经 <font>Sephadex G-25</font> 层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在 <font>1ml</font> <font>1</font> 分钟,收集棕色流出液。如体积大于 <font>5ml</font> ,则以 <font>PEG</font> 浓缩至 <font>5ml</font> 。放置 <font>25ml</font> 小烧杯中,缓慢搅拌。
   <font>(3)</font>  将待标记的抗体 <font>12.5mg</font> 用生理盐水稀释至 <font>5ml</font> ,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
   <font>(4)</font>  用 <font>1M PH9.5</font> 碳酸缓冲液 <font>0.25ml</font> ,继续搅拌 <font>3?</font> 小时。
   <font>(5)</font>  加 <font>0.2M</font> 赖氨酸 <font>0.25ml</font> ,混匀后,置室温 <font>2</font> 小时。
   <font>(6)</font>  在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置 <font>4</font> <font>1</font> 小时。
   <font>(7)</font>   <font>3000rpm</font> 离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量 <font>0.15M PH7.4</font> <font>PBS</font> 中。
   <font>(8)</font>  将上述溶液装入透析袋中,对 <font>0.15M PH7.4</font> <font>PB</font> 缓冲盐水透析,去除铵离子后 <font>(</font> 用萘氏试剂检测 <font>)</font> <font>10,000rpm</font> 离心 <font>30</font> 分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。

   <font>3.</font>  结果判定:
   <font>(1)</font>  定性及效价滴定:用特异性抗原 <font>(</font> 或抗体 <font>)</font> 同酶标记抗体 <font>(</font> 或抗免疫球蛋白抗体 <font>)</font> 作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接 <font>ELISA</font> <font>(</font> 或在正式实验系统里 <font>)</font> 对酶结合物进行滴定 <font>( </font> 见本节 <font> (</font> <font>)</font> 工作浓度的选择 <font>)</font>
   <font>(2)</font>  定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定 <font>(</font> 光程 <font>1cm)</font>
  酶量 <font>(mg</font> <font>ml)</font> <font>OD403nm</font> × <font>0.4<br /> </font>    <font>IgG</font> <font>(mg</font> <font>ml)</font> <font>OD280nm-OD403nm</font> × <font>0.42)</font> × <font>0.94</font> × <font>0.62<br /> <br /> </font>          酶量 <font>(mg</font> <font>ml)</font>    <font> IgG</font> <font>(mg</font> <font>ml) </font>   酶量
  克分子比值=──────── <font> </font> ÷ <font> </font> ─────── <font> </font> <font> </font> ─── <font> </font> × <font> 4<br /> </font>            <font>40,000 </font>        <font>160,000</font>     <font>IgG</font>

    <font>(3)</font>  本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有 <font>2</font> <font>4</font> %的酶与蛋白质结合。

   4.  试剂及器材:
   (1)   0.1M PH6.8 磷酸缓冲盐水 (PBS) :取 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml NaCl1.8 克,加蒸馏水至 200ml
   (2)   1.25 %戊二醛液:取 25 %戊二醛 50ml PH6.8 PBS1ml 混合。
   (3)   1M PH9.5 碳酸盐缓冲液:取 1M 碳酸钠 3ml 1M 碳酸氢钠 7ml 混合。
   (4)   0.2M 赖氨酸溶液:称赖氨酸 29.2mg 溶于 0.01M PH9.5 碳酸缓冲液 1ml 中。
   (5)   0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。
   (6)   PH7.8 饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
   (7)  萘氏试剂及聚乙二醇 (PEG MW2000)
   (8)  纯化的特异性抗体或抗 Ig 抗体。
   (9)   HRP(RZ>3.0)
   (10) Sephadex G-25 层析柱 (2cm × 50cm)
   (11) 搅拌器,分光光度计,离心机。
   (12) 透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。

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