戊二醛二步法制备HRP结合物
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<font>1.</font> 原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶 <font>-</font> 戊二醛 <font>-</font> 免疫球蛋白结合物。
<font>2.</font> 标记步骤:
<font>(1)</font> 称取 <font>HRP25mg</font> 溶于 <font>1.25</font> %戊二醛溶液中,于室温静置过夜。
<font>(2)</font> 反应后的酶溶液经 <font>Sephadex G-25</font> 层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在 <font>1ml</font> / <font>1</font> 分钟,收集棕色流出液。如体积大于 <font>5ml</font> ,则以 <font>PEG</font> 浓缩至 <font>5ml</font> 。放置 <font>25ml</font> 小烧杯中,缓慢搅拌。
<font>(3)</font> 将待标记的抗体 <font>12.5mg</font> 用生理盐水稀释至 <font>5ml</font> ,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
<font>(4)</font> 用 <font>1M PH9.5</font> 碳酸缓冲液 <font>0.25ml</font> ,继续搅拌 <font>3?</font> 小时。
<font>(5)</font> 加 <font>0.2M</font> 赖氨酸 <font>0.25ml</font> ,混匀后,置室温 <font>2</font> 小时。
<font>(6)</font> 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置 <font>4</font> ℃ <font>1</font> 小时。
<font>(7)</font> <font>3000rpm</font> 离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量 <font>0.15M PH7.4</font> 的 <font>PBS</font> 中。
<font>(8)</font> 将上述溶液装入透析袋中,对 <font>0.15M PH7.4</font> 的 <font>PB</font> 缓冲盐水透析,去除铵离子后 <font>(</font> 用萘氏试剂检测 <font>)</font> , <font>10,000rpm</font> 离心 <font>30</font> 分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。
<font>3.</font> 结果判定:
<font>(1)</font> 定性及效价滴定:用特异性抗原 <font>(</font> 或抗体 <font>)</font> 同酶标记抗体 <font>(</font> 或抗免疫球蛋白抗体 <font>)</font> 作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接 <font>ELISA</font> 法 <font>(</font> 或在正式实验系统里 <font>)</font> 对酶结合物进行滴定 <font>( </font> 见本节 <font> (</font> 三 <font>)</font> 工作浓度的选择 <font>)</font> 。
<font>(2)</font> 定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定 <font>(</font> 光程 <font>1cm)</font> 。
酶量 <font>(mg</font> / <font>ml)</font> = <font>OD403nm</font> × <font>0.4<br />
</font> <font>IgG</font> 量 <font>(mg</font> / <font>ml)</font> = <font>OD280nm-OD403nm</font> × <font>0.42)</font> × <font>0.94</font> × <font>0.62<br />
<br />
</font> 酶量 <font>(mg</font> / <font>ml)</font> <font> IgG</font> 量 <font>(mg</font> / <font>ml) </font> 酶量
克分子比值=──────── <font> </font> ÷ <font> </font> ─────── <font> </font> = <font> </font> ─── <font> </font> × <font> 4<br />
</font> <font>40,000 </font> <font>160,000</font> <font>IgG</font> 量
<font>(3)</font> 本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有 <font>2</font> ~ <font>4</font> %的酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材:
(1) 0.1M PH6.8 磷酸缓冲盐水 (PBS) :取 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml , NaCl1.8 克,加蒸馏水至 200ml 。
(2) 1.25 %戊二醛液:取 25 %戊二醛 50ml 与 PH6.8 的 PBS1ml 混合。
(3) 1M PH9.5 碳酸盐缓冲液:取 1M 碳酸钠 3ml 与 1M 碳酸氢钠 7ml 混合。
(4) 0.2M 赖氨酸溶液:称赖氨酸 29.2mg 溶于 0.01M PH9.5 碳酸缓冲液 1ml 中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。
(6) PH7.8 饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
(7) 萘氏试剂及聚乙二醇 (PEG , MW2000) 。
(8) 纯化的特异性抗体或抗 Ig 抗体。
(9) HRP(RZ>3.0) 。
(10) Sephadex G-25 层析柱 (2cm × 50cm) 。
(11) 搅拌器,分光光度计,离心机。
(12) 透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。