制 备 VSV-G 结合物并用于基因传递

制 备 VSV-G 结合物并用于基因传递

材料

试剂
抗-V S V - G 单克隆抗体 P 5D 4 ( Sigma-Aldrich)

B C A 蛋白质定量试剂盒（Pierce， Rockford, Illinois)

细胞培养基

H E K 293 细 胞（A T C C )

磷酸盐缓冲液（P B S )

质粒

报道基因表达质粒（如 E G F P -N l ， B D Biosciences， Palo Alto， California)

V S V - G 表达质粒 p H C M V - G (Yee et al.1994a , b)

Polybrene (4m g / m l 储液）

S D S ——P A G E 和银染试剂

Western blot 分析试剂

受体细胞

蔗 糖（20%) / P B S

仪器

离心机，配 备 S W 2 8 转子和离心管（B e c k m a n)

SDS-PAGE 和银染设备

Western blot 分析设备

微 孔 滤 膜（〇.45um)

细 胞 板（6 孔）

组织培养皿（IOcm)

37°C 水浴

方法

制 备 VSV-G

任何转染方法都可以把 VSV-G 表达质粒转人到细胞中，以表达 VSV-G 蛋白。我们一般选用 HEK293 细胞系，因为它可以用包括 CaP 〇 4_D N A 共沉淀在内的任何方法进行转染，而且都具有高的转染（Yeeetal.1994a， b)。

1•转染 24 h 前 ，在 I O c m 培养皿中，用合适的培养液，以 大 约 7 〇% 的细胞密度接种H E K 293 细胞，生长过夜。

在转染时，细胞密度应该达到 90%〜100%。

2•用标准的 CaPCVDNA 共 沉 淀 方 法 转 染 1 〇〜2 〇ug的 PHCMV-G 质 粒 到 HEK293细胞。

因为 HEK293 细胞对 CaPO4 沉淀的毒性敏感，所以转染时间应短于 8 h。

3.第二天，更换新鲜培养液。

因为 V S V - G 的融合作用，可能形成的多核体，但在这一时间应该还不明显。继续培养过夜。

4 . 此时多核体应该非常明显。收集培养液， 0.45um滤膜过滤，一 70°C 储存。加人新鲜培养液到细胞中，并继续培养过夜。

5.许多细胞可能飘浮起来，收集培养液，同步骤 4 过滤 。 一 70°C 储存或进行纯化。

部 分纯化 VSV-G (简单方法）

6.部分纯化 V S V -G ，步骤如下：
a. 把转染 2d 和 3d 收获的培养基在 37°C 水浴中解冻并混合。将培养液转移到 B e c k-manSW28 转子专用离心管中， 4℃以 25000r/min离心 2h，弃上清。用 5〜IOml P B S 重 悬 沉 淀 。如 果 培 养 基 多 于 200m l ，可 用 大 容 量 转 子 6000〜7000r/m i n 过夜离心来收集 V S V -G 。

b . 低速离心除去不溶性碎片（如 4°C ， 3000r/m i n 离 心 l O m i n)。把上清加到 20%的蔗糖/ P B S (5m l ) 中，置 入 S W 28 转子的离心管中，用 P B S 覆盖并填满离心管， 25 000r/m i n 离 心 6 h 或过夜。弃上清，用 100〜20(V 1P B S 重悬沉淀。

c. 用 BCA 蛋白质定量试剂盒测量 VSV-G 蛋白的浓度。蛋白质纯度经 SD& PAGE、银染和 Western blot 分析估计，使用抗-VSV-G 单克隆抗体 P5D4。

用 VSV-G 转染

7 . 转染前 24 h ，在 6 孔板中，用合适的培养基接种待转染细胞，培养过夜

8•减少孔中的培养液至每孔 lm l, 加 人 POlybr e n e 到 培 养 液 中（4ug/ml)。在一个小离心管中，将 2〜5 ug的质粒 DNA (如 PEGFP-N1 ) 和 10ul 大 约 1ug 的 VSV-G 溶液混合。将其快速加人到细胞中。
也可以将质粒 D N A 直接加人到含有 Im l 培养液的细胞中，培 养 15m in 后 ，加 人 polybrene和 VSV-G 。

9•混匀，置入培养箱中培养 2〜6 h ，然后每孔补加 Im l 新鲜培养基，继续培养。如果碎片较多，洗涤细胞并加 2m l 新鲜培养基。

10•在 1〜3d ， 测量转基因表达，以评估细胞的转染效率