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简易过碘酸钠法制备HRP结合物

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  本法是以 NaIO 先将 HRP 表面的糖分子氧化成醛基,然后再与 Ig 上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近 70 %的 HRP Ig 结合, 99 %的 Ig 与酶结合,酶与 Ig 的活性无重大损失,是目前最常用的方法。

   1.  原理:经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭 HRP 上残留的α - 和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来 Wilson 等改用在低 PH 下使 NaIO 4氧化 HRP ,从而省去了二硝基氟苯封闭 HRP 步骤。 HRP NaIO 4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用 NaBH ( 或乙醇胺 ) 还原生成稳定的酶标记抗体。

   2.  标记步骤 :
   (1)  称取 5mgHRP 溶解于 1ml 蒸馏水中。
   (2)  于上液中加入 0.2ml 新配的 0.1M NaIO 4溶液,室温下避光搅拌 20 分钟。
   (3)  将上述溶液装入透析袋中,对 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析, 4 ℃过夜。
   (4)  加 20 μ l 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯 RP PH 升高到 9.0 9.5 ,然后立即加入 10mg IgG( 抗体,或 SPA5mg) 1ml 0.01M 碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌 2 小时。
   (5)  加 0.1ml 新配的 4mg ml NaBH 4液,混匀,再置 4 2 小时。
   (6)  将上述液装入透析袋中,对 0.15M PH7.4 PBS 透析, 4 ℃过夜。
  其余步骤 ( 纯化 ) 同戊二醛标记步骤的 (6) (7) (8)

   3.  结果判定:
  除标记物 IgG 量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。
   IgG (mg ml) (OD280nm-OD403nm × 0.3) × 0.62

   4.  试剂及器材 :
   (1)   0.1M NaIO 4:称取 241mg 高碘酸钠 ( 广州化学试剂厂,批号 830602) 溶于蒸馏水 10ml 中。
   (2)   1mM PH4.4 醋酸钠缓冲液 :
   0.2M NaAc (1.361 克/ 50ml) 3.7ml
   0.2M HAc (0.601ml 50ml) 6.3ml
  加蒸馏水至 2,000ml
   (3)   0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液 :
        Na CO 0.32
        NaHCO 0.586
       加蒸馏水至 50ml
  再用蒸馏水作 20 倍稀释,即成 0.01M PH9.5 的碳酸盐缓冲液。

   (4)   NaBH 溶液 (4mg ml):
  临用时称取 NaBH 4mg 溶于 1ml 蒸馏水中。

   (5)  其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。

 

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