猪流行性腹泻病毒（PEDV）抗体酶联免疫分析（ELISA）
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猪流行性腹泻病毒（PEDV ）抗体 酶联免疫 分析（ ELISA ）
试剂 盒使用说明书
本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于检测猪血清，血浆及相关液体样本中流行性腹泻病毒（PEDV）抗体水平，感染猪的血液学诊断。
实验原理 ：
本试剂盒 采 用双 抗原 夹心 酶联免疫 法 （ELISA ） 测定 标本 中 猪流行性腹泻病毒（PEDV ）抗体 。用纯化的 猪流行性腹泻病毒（PEDV ） 抗原 包被微孔板，制成固相 抗原 ， 可与样品中流行性腹泻病毒（PEDV ）抗体 相结合 ， 经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后 再与HRP 标记的流行性腹泻病毒（ PEDV ） 抗原 结合，形成 抗原 -抗体 - 酶标 抗原 复合物 ，经过彻底洗涤后 加 底物TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度（ OD 值） ，与CUTOFF 值相比较，从而判定标本中猪流行性腹泻病毒（ PEDV ）抗体 的存在与否。
试剂盒组成 ：
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试剂盒组成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
保存 |
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说明书 |
1份 |
1份 |
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封板膜 |
2片（ 48 ） |
2片（ 96 ） |
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密封袋 |
1个 |
1个 |
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酶标包被板 |
1 ×48 |
1 ×96 |
2-8℃保存 |
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阴性对照 |
0.5ml× 1 瓶 |
0.5ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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阳性对照 |
0.5ml× 1 瓶 |
0.5ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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酶标试剂 |
3 ml× 1 瓶 |
6 ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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样品稀释液 |
3 ml× 1 瓶 |
6 ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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显色剂A 液 |
3 ml× 1 瓶 |
6 ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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显色剂B 液 |
3 ml× 1 瓶 |
6 ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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终止液 |
3ml× 1 瓶 |
6ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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浓缩洗涤液 |
（20ml × 20 倍）× 1 瓶 |
（20ml × 30 倍）× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
样本处理及要求 ：
1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20 ℃保存，但 应 避免反复冻融 .
7. 不能检测含NaN3的样品 ，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP ）活性。
操作步骤 ：
1. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2 孔、 阳性对照2 孔、空白对照 1 孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）
2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50 μl 。然后在 待测样品孔 先加样品稀释液40 μl ，然后再加待测样品10 μl 。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻 晃动 混匀，
3. 温育：用封板膜封板后置37 ℃温育3 0 分钟 。
4. 配液：将30 （ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至 600ml 后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体， 甩干 ，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50 μl ，空白孔除外 。
7. 温育：操作同3 。
8. 洗涤：操作同5 。
9. 显色：每孔先加入显色剂A 50 μl ，再加入显色剂B 50 μl ，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15分钟
10. 终止：每孔加终止 液50μl ，终止反应 （此时蓝色立转黄色） 。
11. 测定：以空白空调零， 4 50 nm波长依序测量各孔的 吸光 度（OD 值） 。 测定应在加终止液后15 分钟以内进行。
结果判定：
试验有效性：阳性对照孔平均值 ≥ 1.00; 阴性对照平均值 ≤ 0.10
临界值（CUT OFF ）计算：临界值 = 阴性对照孔平均值+0.15
阴性判定：样品OD 值 < 临界值（CUT OFF ）者为 流行性腹泻病毒（PEDV ）抗体 阴性
阳性判定：样品OD 值 ≥ 临界值（CUT OFF ）者为 流行性腹泻病毒（PEDV ）抗体 阳性
注意事项
1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。
2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
3． 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出，稀释时可在水浴中加温助溶 ，洗涤时不影响结果。
4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物请避光保存。
6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为 630nm
7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为 2M 的硫酸，使用时必须注意安全。
保存条件及有效期
1． 试剂盒保存： ；2-8 ℃ 。
2．有效期： 6 个月
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