PEDV一种病毒，大家是怎么分离的呀，求救

PEDV（猪流行性腹泻病毒）的分离通常涉及到以下步骤：

1. 采集病毒样本：从猪体内的粪便、肠道、血液等样本中采集病毒样本。

2. 病毒富集：将采集到的样本进行离心、过滤、超速离心等操作，以富集病毒。

3. 细胞培养：将病毒样本接种到感受器细胞上进行培养，例如Vero细胞、PK-15细胞、LLC-PK1细胞等。

4. 病毒分离：观察细胞的形态变化、病毒感染的效果等，通过形态学和免疫学等方法进行初步鉴定，筛选出PEDV病毒阳性的细胞。

5. 病毒纯化：将PEDV阳性的细胞进行单克隆扩增，纯化病毒颗粒。

6. 病毒鉴定：对纯化的病毒进行酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光试验（IFA）、PCR扩增等方法进行鉴定，确认其为PEDV病毒。

1. 采集样本：从受感染的猪群中采集病毒携带者的粪便、肠道组织或粪便悬液等样本。

2. 制备样本：将采集到的样本进行稀释，以减少样本中的杂质和细菌。

3. 筛选：将制备好的样本进行筛选，通过离心、过滤等方法去除大颗粒物质。

4. 病毒扩增：将筛选后的样本接种到适合的宿主细胞中，如Vero细胞或小鼠胚胎细胞等，培养一段时间使病毒扩增。

5. 病毒纯化：使用离心、超滤等方法将细胞碎片、蛋白质等杂质去除，得到纯化的病毒。

6. 病毒鉴定：通过电镜观察病毒形态、免疫学方法检测病毒抗原或核酸检测方法检测病毒基因，确认分离得到的病毒为PEDV。

PEDV的分离培养

    (1) Vero细胞的复苏与培养液氮中取出冻存的Vero细胞一支，迅速放入37℃水浴锅中，迅速融化。加入含有5mL的DMEM完全培养液(预热)的细胞瓶中，37℃ 5% CO2培养箱培养。

    培养48h-60h，镜下观察细胞生长状态。待细胞长为单层，进行细胞传代。弃去培养基，用PBS洗液将细胞清洗3次;加入0.25%的EDTA-胰酶，800u L/孔，轻轻摇晃几次，37℃平置2-3min，取出;镜下观察，看细胞间隙变大，细胞变圆，加入DMEM完全培养基，用移液器依次吹打整个瓶底，使细胞脱落; 将细胞悬液分加入到细胞培养瓶中，5ml/瓶，摇匀，放于37℃ 5%CO2培养箱中继续培养。

    (2) PEDV接种

    将处理保存的病料样品取出，在无菌操作台中用0.22um滤膜过滤，收集滤液。

    取生长为均匀单层Vero细胞，弃培养液，PBS洗液洗3次，加入病料滤液，1 ml/瓶，轻轻摇晃几次，放于37℃ CO2培养箱中孵育1-1.5h，期间轻摇2-3次。之后，弃去接种液，加入含10ug/ml的维持液5ml。37℃ CO2培养箱中培养，每天观察，待细胞出现80%CPE时，收毒于-80 ℃，反复冻融3次，用于下次接种。如若接毒后72-96h没有病变，收集细胞培养产物，反复冻融3次，继续盲传，直到出现细胞病变。