猪弓形虫抗体酶联免疫分析（ELISA）

猪弓形虫抗体 酶联免疫 分析（ ELISA ）

试剂 盒使用说明书

本试剂仅供研究使用          目的：本试剂盒用于测定猪血清，血浆及相关液体样本中 弓形虫抗体 。

实验原理 ：

   本试剂盒 采 用双抗 原 夹心 酶联免疫 法 （ELISA ） 测定 标本 中 猪 弓形虫抗体 。用纯化的 猪 弓形虫抗原 包被微孔板，制成固相抗 原 ， 可与样品中猪 弓形虫抗体相结合 ， 经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后 再与HRP 标记的猪 弓形虫抗原 结合，形成抗原- 抗体 - 酶标抗原复合物 ，经过彻底洗涤后 加 底物TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度（ OD 值） ，与CUTOFF 值相比较，从而判定标本中猪 弓形虫抗体的存在与否。

 

试剂盒组成 ：

试剂盒组成	48孔配置	96孔配置	保存
说明书	1份	1份
封板膜	2片（ 48 ）	2片（ 96 ）
密封袋	1个	1个
酶标包被板	1 ×48	1 ×96	2-8℃保存
阴性对照	0.5ml× 1 瓶	0.5ml× 1 瓶	2-8℃保存
阳性对照	0.5ml× 1 瓶	0.5ml× 1 瓶	2-8℃保存
酶标试剂	3 ml× 1 瓶	6 ml× 1 瓶	2-8℃保存
样品稀释液	3 ml× 1 瓶	6 ml× 1 瓶	2-8℃保存
显色剂A 液	3 ml× 1 瓶	6 ml× 1 瓶	2-8℃保存
显色剂B 液	3 ml× 1 瓶	6 ml× 1 瓶	2-8℃保存
终止液	3ml× 1 瓶	6ml× 1 瓶	2-8℃保存
浓缩洗涤液	（20ml × 20 倍）× 1 瓶	（20ml × 30 倍）× 1 瓶	2-8℃保存

 

样本处理及要求 ：

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20 ℃保存，但 应 避免反复冻融 .

7.  不能检测含NaN3的样品 ，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP ）活性。

 

操作步骤 ：

1.  编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2 孔、 阳性对照2 孔、空白对照 1 孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2.  加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照（标准品）100 μl 。然后在 待测样品孔 先加样品稀释液50 μl ，然后再加待测样品50 μl 。 轻轻 晃动 混匀，

3.  温育：用封板膜封板后置37 ℃温育3 0 分钟 。   

4.  配液：将20 倍浓缩洗涤液加蒸馏水至 1000ml 后备用

5.  洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体， 甩干 ，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶标试剂50 μl (或一滴 ) ，空白孔除外 。 

7.  温育：操作同3 。

8.  洗涤：操作同5 。

9.  显色：每孔先加入显色剂A 50 μl (或一滴 ) ，再加入显色剂 B 50 μl (或一滴 ) ，轻轻震荡混匀， 37 ℃避光显色15分钟

10.  终止：每孔加终止 液50μl (或一滴 ) ，终止反应 （此时蓝色立转黄色） 。

11.  测定：以空白空调零， 4 50 nm波长依序测量各孔的 吸光 度（OD 值） 。   测定应在加终止液后15 分钟以内进行。

 

结果判定：

   试验有效性：阳性对照孔平均值 ≥ 1.00; 阴性对照平均值 ≤ 0.15

  临界值（CUT OFF ）计算：临界值 = 阴性对照孔平均值+0.10 （阴性对照平均值低于 0.05 按 0.05 计算）

  阴性判定：样品OD 值 <  临界值（CUT OFF ）者为猪弓形虫抗体阴性

  阳性判定：样品OD 值 ≥  临界值（CUT OFF ）者为猪弓形虫抗体阳性

注意事项

1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。

2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

3． 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出，稀释时可在水浴中加温助溶 ，洗涤时不影响结果。

4．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物请避光保存。

6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为 630nm

7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为 2M 的硫酸，使用时必须注意安全。

 

保存条件及有效期

1． 试剂盒保存： ；2-8 ℃ 。

2．有效期： 6 个月

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