检测猪流行性腹泻病毒抗体

实验试剂

1. 聚苯乙烯塑料微量组织培养板：4×10孔。

2. 包被液(pH9.6)：NaHCO₃ 29.3g、Na₂ CO₃ 19.5g，蒸馏水加至1000ml，置4℃保存。

3. 洗涤液(0.01mol/L、pH7.4PBS)：NaCl 8.0g、KH₂ PO₄ 0.2g、Na₂ HPO₄ •12 H₂ O 2.9g、KCl 0.2g、Tween20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。

4. 保温液：牛血清白蛋白(BSA) 0.1g、0.05% PBSTween20 100ml，4℃保存。

5. 底物溶液(OPDH₂ O₂ )

磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)：0.2mol/L Na₂ HPO₄ (28.4g/L)25.7ml、0.1mol/L柠檬酸(19.2g/L)24.3ml、蒸馏水50ml。

底物溶液：磷酸盐柠檬酸缓冲液100ml、邻苯二胺(OPD)40mg、30%H₂ O₂ 0.15ml，现配现用。

6. 终止液(2mol/L H₂ SO₄ )：浓硫酸22.2ml、蒸馏水177.8ml。

7. 猪流行性腹泻(PED)抗原：PEDV猪胎肠原代细胞培养物，反复冻融，65℃ 30min灭活。最后以3 000 r/min离心30min，取上清分装，-20℃保存备用。抗原的蛋白浓度为300μg/ml。

8. 酶标兔抗猪抗体结合物：酶结合物效价为1∶10 000。

9. 被检猪血清：采自疫区猪和病猪。PEDV免疫猪血清及健猪血清分别用于阳性、阴性对照。

实验设备

酶联免疫吸附试验检测仪

实验步骤

1. 抗原包被：用包被液将PEDV抗原作1∶5稀释包被反应板，每孔100μl，同时设阴性细胞培养物对照孔，置4℃过夜。

2. 洗涤：用洗涤液洗涤2次，每次2min，沥干。

3. 加入被检血清：用保温液将被检血清作1∶100稀释，加入反应板相邻的两个孔中，每孔100μl。同时作阴、阳性标准血清对照，置37℃孵育1h。

4. 洗涤3次：方法同上。

5. 加入酶结合物：用保温液将酶结合物作1∶4 000稀释，加入反应孔中，每孔100μl，置37℃孵育1h。

6. 洗涤3次：方法同上。

7. 加入底物：每孔100μl，置室温暗盒内显色20min。

8. 加入终止液：每孔50μl，静置5min。

9. 测定OD值：用检测仪，于492nm波长，按仪器使用及制定标准要求调节仪器，测定各反应孔的OD值，记录结果。

结果判定凡检测血清P/N值超过14的，均判为阳性。肉眼观察，凡反应孔的颜色比正常细胞对照孔、正常血清对照孔颜色深者为阳性。

注意事项

1. 在各载体中使用最多的为聚苯乙烯塑料板。不同厂牌，甚至不同批号的反应板吸附性能往往有很大差异，因此使用前需要加以选择。方法为：在整块板上测定同一标本，求出每一对孔的平均OD值，将此值与该板的总均值相比，其差值需在±10%以内。

2. 为了增加聚苯乙烯板对某些抗原或抗体的吸附作用，可试用鞣酸处理，牛血清白蛋白处理，改变载体的表面电荷，引入化学基团等方法处理反应板。

3. 如非特异性吸附较强，需考虑采用封闭等方法排除。

1) 封闭：可选用4%～10%牛血清白蛋白、10%小牛血清、10%马血清、01%～25%明胶等。

2) 去污剂：可阻止非特异吸附，而不影响特异性抗原抗体反应。常用的有005%～05%吐温20、吐温80、01%NP40等。

3) 高盐浓度缓冲液：如含05mol/L NaCl及0.05%吐温的磷酸盐缓冲液(pH8)。

4) 缩短孵育时间：保温液中加入终浓度4%的聚乙二醇(PEG，MW6 000)

可缩短抗原抗体反应的孵育时间(20min以内)。

4. 由于反应板可能存在边缘效应，因此测定标本时至少要取两孔的平均值。

5. 各种常用的酶标反应比色计性能不一，测定时需根据各自的仪器确定阈值。