外源基因在原核细胞表达技术
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原核细胞
l 用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1. PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段,片段 5’ 端和 3’ 端带有与 IPTG 诱导表达载体对应的限制酶位点。
2. 含靶 cDNA/ 基因的 DNA 片段与表达载体连接。
3. 重组质粒转化有 lacI q 等位基因的大肠杆菌菌株。如果质粒本身有 lacI 基因,可以使用任何适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄( 50 μ g/ml )的 LB 平板,于 37 ℃过夜培养。
4. 通过菌落杂交和 / 或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担,导致形成包涵体。
5. 对照菌和重组菌分别挑取 1 ~ 2 个菌落,接入 1 ml 含氨苄青霉素( 50 μ g/ml )的 LB 培养液,适当温度( 20 ~ 37 ℃)培养过夜。
大肠杆菌在室温的生长速率比在 37 ℃慢 4 倍,所以~ 20 ℃培养过夜( 16 h )可能达不到饱和。但低温时细菌代谢缓慢,不容易形成包涵体。
6. 取 50 μ l 过夜培养物接入 5 ml 含氨苄青霉素( 50 μ g/ml )的 LB 培养液, 20 ~ 37 ℃振荡培养 2 h 以上,至对数中期( A550 =0.5 ~ 1.0 )。
7. 吸出 1 ml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中,按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。
8. 在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1 mmol/L , 20 ~ 37 ℃继续通气培养。
IPTG 的浓度对表达水平影响非常大。 1 mmol/L 只是一个起点,也是一个比较高的浓度。实验中,应在 0.01 ~ 5.0 mmol/L 的范围内改变 IPTG 浓度,寻找最佳使用浓度。对于有些蛋白,必须诱导表达质粒慢转录,才不致于使细菌的生物合成系统过载。
影响在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长温度,通过实验确定最佳温度,是表达外源蛋白的关键。虽然在 15 ~ 42 ℃之间都获得过成功表达,但表达某一种特定蛋白质的最佳温度范围则可能很窄,只有 2 ~ 4 ℃。温度有时对表达水平起着决定作用,而有时却对表达水平没有任何影响,这其中的原因还有待进一步研究,但可能是诸多因素单独或同时作用的结果。这些因素包括:细菌生长速率、表达产物的胞内折叠、辅基(血红素、黄素、腺嘌呤二核苷酸、生物素等)的可获得性、外源蛋白的热变性、细胞分泌或折叠器的过载、内原蛋白酶或其他裂解酶的活性、细菌 SOS 修复系统的激活等。由于这些不确定因素的存在,理论推断最佳生长温度是不可靠的,必须进行反复的实验。
9. 在诱导的不同时间(如 1 、 2 、 4 和 6 h )取 1 ml 样品放于微量离心管中,测定 A550 ,室温高速离心 1 min 。
10. 沉淀悬于 100 μ l 1 × SDS 凝胶加样缓冲液, 100 ℃加热 3 min ,室温高速离心 1 min ,冰上放置,待全部样品处理完后上样。
11. 样品加热至室温,取 40 μ g 或相当于 0.15 OD550 培养物的悬液上于 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
12. 8 ~ 15 V/cm 点泳,至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13. 考马斯亮蓝染色或银染,或免疫印迹,观察表达产物条带。
37 ℃诱导 30 min 的阳性对照,有一条分子质量为 26 kDa 的谷胱甘肽 -S- 转移酶( GST )带, GST 的量在诱导过程中持续升高。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带,诱导动力学和蛋白稳定性可能不同于 GST 对照。
大量表达靶蛋白
14. 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 50 ml 含氨苄( 50 μ g/ml )的 LB 培养液,在 250 ml 摇瓶中于 20 ~ 37 ℃过夜培养。
15. 取 5 ~ 50 ml 过夜培养物接入 450 ~ 500 ml 含氨苄( 50 μ g/ml )的 LB 培养液,在 2L 摇瓶中于 20 ~ 37 ℃振荡培养过夜,至对数中期( A550 =0.5 ~ 1.0 )。
16. 以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。
17. 诱导适当时间后,于 4 ℃以 5000g ( 5500 r/min Sorvall GSA 转头)离心 15 min 收集细胞,继续后面的纯化方案。
l 用 T7 噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆基因
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1. PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段,片段 5’ 端和 3’ 端带有与 T7 噬菌体启动子表达质粒(如 pET 载体; Studier et al. 1990 )对应的限制酶位点。
2. 含靶 cDNA/ 基因的 DNA 片段与表达载体连接。
3. 连接产物转化大肠杆菌菌株 HMS174 ( DE3 )或 BL21 ( DE3 )。将转化体铺于含氨苄( 50 μ g/ml )的 NZCYM 平板,于 37 ℃过夜培养。
4. 通过菌落杂交和 / 或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担,导致形成包涵体。
5. 对照菌和重组菌分别挑取 1 ~2个菌落,接入 1 ml 含氨苄青霉素( 50 μ g/ml )的 NZCYM 培养液, 37 ℃培养过夜至饱和。
6. 取 50 μ l 接入 5 ml 含氨苄青霉素( 50 μ g/ml ) NZCYM 培养液,在 50 ml 摇瓶中于 37 ℃培养 2 h 。
7. 吸出 1ml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中,按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。
8. 在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1 mmol/L , 20 ~ 37 ℃继续通气培养。
9. 在诱导的不同时间( 0.5 、 1 、 2 和 3 h )取 1 ml 样品放于微量离心管中,测定 A550 ,室温高速离心 1 min 。
10. 沉淀悬于 100 μ l 1 × SDS 凝胶加样缓冲液, 100 ℃加热 3 min ,室温高速离心 1 min ,冰上放置,待全部样品处理完后上样。
11. 样品加热至室温,取 40 μ g 或相当于 0.15 OD550 培养物的悬液上样于 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
12. 8 ~ 15 V/cm 电泳,至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13. 考马斯亮蓝染色或银染,或免疫印迹,观察表达产物条带。
大量表达靶蛋白
14. 挑取重组和对照大肠杆菌菌落分别接入 50 ml 含氨苄( 50 μ g/ml )的 NZCYM 培养液,在 250 ml 摇瓶中于 37 ℃过夜培养。
15. 取 5 ~ 50 ml 过夜培养物接入 450 ~ 500 ml 含氨苄( 50 μ g/ml )的 NZCYM 培养液,在 2 L 摇瓶中于 37 ℃振荡培养至对数中期( A550 =0.5 ~ 1.0 )。
16. 以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。
17. 诱导适当时间后,于 4 ℃以 5000g ( 5500 r/min Sorvall GSA 转头)离心 15 min 收集细胞,继续后面的纯化方案。