外源基因在原核细胞表达技术

原核细胞

 

l      用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因

 

 

 

含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建

 

1.      PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5’ 端和 3’ 端带有与 IPTG 诱导表达载体对应的限制酶位点。

 

2.      含靶 cDNA/ 基因的 DNA 片段与表达载体连接。

 

3.      重组质粒转化有 lacI ^q 等位基因的大肠杆菌菌株。如果质粒本身有 lacI 基因，可以使用任何适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄（ 50 μ g/ml ）的 LB 平板，于 37 ℃过夜培养。

 

4.      通过菌落杂交和 / 或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体。

 

 

 

诱导靶蛋白表达的优化

 

 

 

许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。

5.      对照菌和重组菌分别挑取 1 ～ 2 个菌落，接入 1 ml 含氨苄青霉素（ 50 μ g/ml ）的 LB 培养液，适当温度（ 20 ～ 37 ℃）培养过夜。

 

大肠杆菌在室温的生长速率比在 37 ℃慢 4 倍，所以～ 20 ℃培养过夜（ 16 h ）可能达不到饱和。但低温时细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体。

 

6.      取 50 μ l 过夜培养物接入 5 ml 含氨苄青霉素（ 50 μ g/ml ）的 LB 培养液， 20 ～ 37 ℃振荡培养 2 h 以上，至对数中期（ A₅₅₀ =0.5 ～ 1.0 ）。

 

7.      吸出 1 ml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。

 

8.      在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1 mmol/L ， 20 ～ 37 ℃继续通气培养。

 

IPTG 的浓度对表达水平影响非常大。 1 mmol/L 只是一个起点，也是一个比较高的浓度。实验中，应在 0.01 ～ 5.0 mmol/L 的范围内改变 IPTG 浓度，寻找最佳使用浓度。对于有些蛋白，必须诱导表达质粒慢转录，才不致于使细菌的生物合成系统过载。

 

影响在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是表达外源蛋白的关键。虽然在 15 ～ 42 ℃之间都获得过成功表达，但表达某一种特定蛋白质的最佳温度范围则可能很窄，只有 2 ～ 4 ℃。温度有时对表达水平起着决定作用，而有时却对表达水平没有任何影响，这其中的原因还有待进一步研究，但可能是诸多因素单独或同时作用的结果。这些因素包括：细菌生长速率、表达产物的胞内折叠、辅基（血红素、黄素、腺嘌呤二核苷酸、生物素等）的可获得性、外源蛋白的热变性、细胞分泌或折叠器的过载、内原蛋白酶或其他裂解酶的活性、细菌 SOS 修复系统的激活等。由于这些不确定因素的存在，理论推断最佳生长温度是不可靠的，必须进行反复的实验。

9.      在诱导的不同时间（如 1 、 2 、 4 和 6 h ）取 1 ml 样品放于微量离心管中，测定 A₅₅₀ ，室温高速离心 1 min 。

 

10.  沉淀悬于 100 μ l 1 × SDS 凝胶加样缓冲液， 100 ℃加热 3 min ，室温高速离心 1 min ，冰上放置，待全部样品处理完后上样。

 

11.  样品加热至室温，取 40 μ g 或相当于 0.15 OD₅₅₀ 培养物的悬液上于 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶。

 

12.  8 ～ 15 V/cm 点泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。

 

13.  考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带。

 

   37 ℃诱导 30 min 的阳性对照，有一条分子质量为 26 kDa 的谷胱甘肽 -S- 转移酶（ GST ）带， GST 的量在诱导过程中持续升高。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带，诱导动力学和蛋白稳定性可能不同于 GST 对照。

 

 

 

大量表达靶蛋白

 

14.  挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 50 ml 含氨苄（ 50 μ g/ml ）的 LB 培养液，在 250 ml 摇瓶中于 20 ～ 37 ℃过夜培养。

15.  取 5 ～ 50 ml 过夜培养物接入 450 ～ 500 ml 含氨苄（ 50 μ g/ml ）的 LB 培养液，在 2L 摇瓶中于 20 ～ 37 ℃振荡培养过夜，至对数中期（ A₅₅₀ =0.5 ～ 1.0 ）。

16.  以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。

17.  诱导适当时间后，于 4 ℃以 5000g （ 5500 r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞，继续后面的纯化方案。

 

 

l      用 T7 噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆基因

 

含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建

 

1.      PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5’ 端和 3’ 端带有与 T7 噬菌体启动子表达质粒（如 pET 载体； Studier et al. 1990 ）对应的限制酶位点。

2.      含靶 cDNA/ 基因的 DNA 片段与表达载体连接。

3.      连接产物转化大肠杆菌菌株 HMS174 （ DE3 ）或 BL21 （ DE3 ）。将转化体铺于含氨苄（ 50 μ g/ml ）的 NZCYM 平板，于 37 ℃过夜培养。

4.      通过菌落杂交和 / 或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体。

 

 

诱导靶蛋白表达的优化

 

许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。

5.      对照菌和重组菌分别挑取 1 ～２个菌落，接入 1 ml 含氨苄青霉素（ 50 μ g/ml ）的 NZCYM 培养液， 37 ℃培养过夜至饱和。

6.      取 50 μ l 接入 5 ml 含氨苄青霉素（ 50 μ g/ml ） NZCYM 培养液，在 50 ml 摇瓶中于 37 ℃培养 2 h 。

7.      吸出 1ml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。

8.      在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1 mmol/L ， 20 ～ 37 ℃继续通气培养。

9.      在诱导的不同时间（ 0.5 、 1 、 2 和 3 h ）取 1 ml 样品放于微量离心管中，测定 A₅₅₀ ，室温高速离心 1 min 。

10.  沉淀悬于 100 μ l 1 × SDS 凝胶加样缓冲液， 100 ℃加热 3 min ，室温高速离心 1 min ，冰上放置，待全部样品处理完后上样。

11.  样品加热至室温，取 40 μ g 或相当于 0.15 OD₅₅₀ 培养物的悬液上样于 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶。

12.  8 ～ 15 V/cm 电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。

13.  考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带。

 

 

大量表达靶蛋白

 

14.  挑取重组和对照大肠杆菌菌落分别接入 50 ml 含氨苄（ 50 μ g/ml ）的 NZCYM 培养液，在 250 ml 摇瓶中于 37 ℃过夜培养。

15.  取 5 ～ 50 ml 过夜培养物接入 450 ～ 500 ml 含氨苄（ 50 μ g/ml ）的 NZCYM 培养液，在 2 L 摇瓶中于 37 ℃振荡培养至对数中期（ A₅₅₀ =0.5 ～ 1.0 ）。

16.  以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。

17.  诱导适当时间后，于 4 ℃以 5000g （ 5500 r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞，继续后面的纯化方案。