外源基因在真核细胞表达步骤

在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。

1、克隆

选用合适 的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果选用的是分泌型表达载体，则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。

2、重组栽体线性化

重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。如对载体

pPC19选用BgiⅡ线性化，转化后可得到Muts表型转化子；选用SaI或StuI线性化，转化后可得到Mut表型转化子。

3、转化

目前对真核细胞的转化方法有多种，例如对于P.Pastoris的转化目前有4种方 法：

①锂盐法；

②PEG法；

③原生质球法；

④电穿孔法。

锂盐法和PEG法方法简便，但效率很低，每微克DNA只有几十个转化子或更低，一般不多用。

原生质球法和电穿孔法转化率都较高，而且一般可得到高拷贝重组，其转化率都可达到105/μg。但原生质球法操作繁琐费时；电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。选用上述四种方法中的一种转化。一般选用原生质球或电击法。

4、筛选

转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取转化子DNA，用外 源基因两侧特异引物扩增筛选。然而，这只限于少量转化子转化子太多，则工作量太大。对于大量转化子的筛选．可用原位点杂交进行。

即把相同量的不同转化子点在NC膜上，在原位对酵母细胞壁进行裂解，使之释放DNA。DNA经变性、中和后，可和由外源基因制备的探针杂交。用这种方法，在一张Nc膜上，可完成对几百个转化子的筛选。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子，而且可以鉴定多拷贝。这是因为当点到NC膜上的菌量相同时，转化子中外源基因拷贝数越多，则杂交后信号越强。

5、鉴定表型

筛选出的转化子需鉴定表型，以酵母为例，即确定是Mut+还是Muts。这两种不同表型在诱导表达的条件上有差异。可以把转化子同时点在MD和MM两块板上。在MD和MM板上生长差别不大的转化子为Mut+；相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的转化子为Mutd。

6、诱导表达

外源蛋白在真核细胞中的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以培养基上培养菌体，达到一定OD值后，离心弃上清，菌体悬浮于以液体培养基中诱导表达。表达的条件有待优化，如通气状况，pH值，培养基的组成等等。一旦最佳条件确定，则可以按比例放大。从摇瓶培养转至大规模发酵。