VPN会哦路
我用pET32a载体,酶切位点EcoRI和XhoI,目的片段长度1326bp(没有终止子),诱导之后跑了胶,如下图:
1:Marker,
2:32a空载诱前;
3:32a空载30℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后;
4:重组载体诱前;
5:重组载体30℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后;
6:重组载体30℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后超声上清;
7:重组载体30℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后超声沉淀;
8:重组载体20℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后;
9:重组载体20℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后超声上清;
10:重组载体20℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后超声沉淀;
图片中显示,诱导后,出现了两个条带,我判断的是位于上面的那一条是我做的目的蛋白,下面一条是什么?我判断的对吗?大家可以看下吗,
冷泉港蛋白
你的蛋白理论计算应该是20+46=66kd,
1.上面的条带略高吧,也可以解释通。
2.下面的条带应该是目的蛋白降解了,没有其他解释了,这个蛋白应该是超级不稳定。
3.下面的条带如何证明是目的条带,抠胶打个质谱,花钱,也没有必要;纯化出来,37℃放置,第二天跑胶,估计就降解很多了
4.如何解决这个降解问题,更换缓冲估计不行了,换载体吧
bamboopiggy
我感觉我好像昨天回答过这个问题,你的蛋白,按照1326bp计算,大概是50kd,再家上his-tag大概0.8 kd也到不了70多kd啊,所以你上面的那个条带可能是有别的修饰?要不你你找个抗体,用wb杂一下试试。
Eason老歌迷
是不是你的蛋白有降解或者是它有非特异性条带呢?
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