腺病毒载体综述

腺病毒的一般特性

    腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体（ Stewart et al., 1993 ）。其病毒壳体含有三种主要的蛋白：六邻体（ II ），五邻体基底（ III ）和纤突（ IV ），还有多种其他的辅助蛋白 VI ， VIII ， IX ， IIIa 和 Iva2 （ Fig. 1 ）。腺病毒基因组是一个线性的双链 DNA ，其 5’ 端与一种末端蛋白（ TP ）共价结合（ Rekosh et al., 1977 ）， 5’ 端上还具有末端反向重复序列（ ITRs ）。病毒 DNA 与核心蛋白 VII 和一个称为 mu 的小肽紧密结合（ Anderson et al., 1989 ）。另一种蛋白 V 包被在 DNA- 蛋白复合物上，并且通过蛋白 VI 为 DNA- 蛋白复合物和病毒壳体间提供了结构上的联系（ Matthews & Russell, 1995 ）。病毒含有一种病毒自身编码的蛋白酶（ Weber, 1976; Webster et al., 1989 ），这种蛋白酶对于加工某些结构蛋白从而产生成熟的具有感染性的病毒是必需的。

    腺病毒家族（ Adenoviridae ）的成员可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，脑细胞和心脏细胞。因为腺病毒可将自身的基因组递送到细胞核中，并且高效率地复制，所以腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者。腺病毒的宿主范围很宽，目前可将之分为三个属，进一步可分为 6 个种（或称为亚属或亚群），编号从 A 到 F 。主要基于免疫学标准的人血清型的划分，已经由于历史原因而成为腺病毒分类的基础（ Benkö et al., 1999; Lukashok & Horwitz, 1998; Mautner, 1989 ）。有些腺病毒在动物体内可致瘤，在体外能转化细胞，此处未列出相关文献。

腺病毒载体的应用

       腺病毒载体可高效地传递和表达基因的能力（尤其是在体外），在过去的 15 年里已经得到充分地证实和记载。然而，体内的免疫反应限制了腺病毒载体的实际应用和发展。因此，在要求转基因持续表达以弥补缺损基因活性的病例中，非常关键的一点就是控制或抑制针对病毒载体和转基因的免疫反应。相反的，癌症治疗却可因活跃的免疫反应的诱导产生而增加疗效。随着人们对于生物分子和免疫因子在体内作用过程的理解逐渐加深，在过去的几年里，人们已经在构建更有效的载体方面取得了大跨步的发展，这里将会描述其中的一些方面。  

癌症的基因治疗

      在多个病例中，根据肿瘤的类型和分布，采用了多种技术来抑制和消除肿瘤细胞。大部分的载体是通过体外肿瘤模型而研制出来的，并且在适宜的动物模型上接受了检测，其中有些动物模型是通过肿瘤移植方法而建立的。现在，这些途径中有许多已经应用到了临床试验中。正在使用中的治疗方法可分为三类：（ i ）肿瘤抑制基因或肿瘤消除基因，（ ii ）可溶解肿瘤和增强药物敏感性的治疗，（ iii ）疫苗。

   （ i ） 肿瘤抑制 / 消除基因。由于突变而造成功能丧失的 p53 基因与许多种人类肿瘤的形成相关（ Wills et al., 1994 ）。为了治疗这种缺陷并诱导肿瘤细胞的凋亡，已构建了多种携带野生型 p53 基因的载体。在开始的研究中，通过适当的肿瘤细胞系及尔后的动物模型系统，证明了这些途径对于退行发育的甲状腺癌（ Blagosklonny et al., 1998 ）、人恶性神经胶质瘤（ Cirielli et al., 1999; Li et al., 1999 a ）和乳腺癌（ Putzer et al., 1998 ）治疗的有效性。在有些病例中，载体与某种免疫调节基因如 IL-2 （ Putzer et al., 1998 ）或与某种细胞毒性药物如阿霉素（ Blagosklonny et al., 1998 ）结合使用，疗效更为显著。检测这些载体对于肺癌、头部癌，颈癌和肝癌的疗效的临床试验正在进行中。然而，这种治疗途径固有的问题之一是载体有效的靶向性，而经由肝动脉直接注射来治疗肝癌的方法已在一个小鼠模型上经过了试验（ Anderson et al., 1998 ）。最新的研究引人注目地显示了 ARF-mdm2-p53 的交互作用在调节 p53 基因表达的过程中的重要性，而在多种肿瘤中发现的 ARF 和相关的转录因子如 Twist （ Maestro et al., 1999 ）的一系列突变（ Eischen et al., 1999; Sanchez-Cespedes et al., 1999; Taniguchi et al., 1999 ）暗示了表达 p53 作用途径中的其他成分的载体可能也可以达到同样的疗效。其他诱导凋亡的途径也已得到探索，而这些途径涉及到对于细胞周期非常关键的细胞周期蛋白依赖性的激酶。实际上，其中一种激酶 p16 已经在多种人类肿瘤细胞系中显示出有缺损，而表达 p21 、 p15 和 p16 的载体也已在肿瘤模型系统中显示出有效治疗的希望（ Tsao et al., 1999 ）。表达前凋亡蛋白如 Fas 配体和 caspase-8 的载体的使用却因载体生产方法存在困难而受到限制。但是，最近所构建的表达腺病毒 E3 14.7K 蛋白或表达痘病毒 serpin 基因 Crm.A 的互补细胞系已提供了良好的生产和探索这些病毒载体的特性的途径（ Bruder et al., 2000 ）。另一种促进细胞凋亡的令人感兴趣的途径是核酶的使用，例如用抗 H-ras 的核酶治疗膀胱癌（ Irie et al., 1999 ），用抗 Bcl-2 的核酶治疗前列腺癌（ Dorai et al., 1999 ），以及用抗 HER2 的核酶治疗乳腺癌（ Suzuki et al., 2000 ）。

   （ ii ） 可溶解肿瘤和增强药物敏感性的治疗。 20 世纪 50 年代发现了野生型腺病毒之后不久，就尝试了将野生型腺病毒直接注入肿瘤内，但只显示出局部的疗效。然后直到 1996 年才有人宣称，带有 E1B 55k 基因突变的腺病毒可选择性地在 p53 缺陷的肿瘤细胞中复制（ Bischoff et al., 1996 ），因此可以作为溶解肿瘤的病毒来发挥作用。这导致了该种突变体（ Onyx 015 ）的商业化发展。而且，虽然有很多文献令人信服地说明原先的前提没有持续下去（ Hay et al., 1999 a; Ridgway et al., 1997; Vollmer et al., 1999 ），但仍然声称静脉注射这种病毒可以有效地治疗某些肿瘤（ Heise et al., 1999 ）。与标准的化疗相结合看起来也很有希望（ Heise et al., 1997 ），用 Onyx 治疗头颈部癌的 III 期临床试验正在进行中。另外，最近的一项研究同时使用了 E1B 缺失的腺病毒和表达 IL-2 的腺病毒载体，在一个鼠模型中使 p53 缺陷导致的胰腺癌完全消退了（ Motoi et al., 2000 ）。

    研制出来的另一种选择性地消除肿瘤细胞的策略是通过载体将一种前体药物酶递送到靶细胞中，然后注射一种非毒性药物，这种药物可在原位转变成一种细胞毒素剂（ Crystal, 1999 ）。单纯疱疹病毒胸苷激酶（ HSV-tk ）被广泛地作为所谓的自杀基因来使用，因为注射 9-1;3- 二羟 -2- 丙氧甲基鸟嘌呤之后，该药物将被 HSV-tk 磷酸化，从而释放出 DNA 合成的链终止因子。这一技术已经用于头颈部癌的原位治疗（ Goebel et al., 1998 ），并且完成了恶性间皮瘤（ Sterman et al., 1998 ）和前列腺癌（ Herman et al., 1999 ）治疗的 I 期临床试验。同时缺失 E1 和 E4 区的病毒载体最近已构建出来，用于传递 HSV-tk 基因（ Lanuti et al., 1999 ），显然此种载体效果更好。胞嘧啶脱氨酶（ CD ）也作为自杀基因用于治疗结肠癌，以腺病毒为载体，并且同时注射 5- 氟胞嘧啶（ Hirschowitz et al., 1995 ）。 HSV-tk 和 CD 基因的融合基因也被插入到载体中用于治疗前列腺癌（ Blackburn et al., 1999 ）。一种含有三种形式的疗法，即涉及到含有 HSV-tk 和 CD 双自杀基因载体结合放疗的疗法，以证明对于一个宫颈癌异种移植物的肿瘤消减非常有效（ Rogulski et al., 2000 ）。另一个令人感兴趣的途径是与 CD 载体共注射一种含有尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的载体。在一个大鼠肿瘤模型中，这一途径极大地增加了系统的敏感性（ Adachi et al., 2000 ）。这些疗法还伴随出现了所谓的 “ 旁观者效应 ” ，增强了细胞毒效应（ Zhang & DeGroot, 2000 ）。

    递送各种细胞因子的载体可以补助含有自杀基因的载体的作用，从而增强原位的细胞毒性（ Cao et al., 1998 ）。

   在所有的这些系统中，很明显的一点是，如果靶向性更高，疗效将会大大增加；组织特异的启动子可以整合进入载体中以促进这一点的实现（ Hart, 1996 ）。已有报道这一技术在乳腺癌（ Manome et al., 1994 ）、肝癌（ Kaneko et al., 1995 ）和黑色素瘤（ Siders et al., 1998 a ）治疗中的应用。然而，虽然在体内已经实现了目标的特异性，但结果经常令人失望，因为启动子的活性相当低。一个试图改善这一不足的尝试采用了一种精巧的策略，该实验在一个动物模型中使用了 Cre-lox 系统（补体受体增强作用 - 液氧系统）和一个肿瘤特异性抗原，由此获得了很有希望的结果（ Kijima et al., 1999 ）。

    还应该列出关于在载体中保留 E1A 基因的重要性的文献，因为在这些病例中，这种载体能够促进 P53 转录，同时提高肿瘤细胞对细胞毒性试剂（ Brader et al., 1997; Cook et al., 1999; Wildner et al., 1999 ）和对放疗（ Martin-Duque et al., 1999 ）的敏感性。  

     （iii） 疫苗。对于激活抗肿瘤细胞免疫的策略已经通过载体的使用进行了探索。在这些尝试中，多种免疫调节基因和 / 或肿瘤特异抗原基因通过载体导入体内。许多细胞因子可以以这种方式发挥作用：如此， IL-2 能够诱导 CTLs ，促进 NK 细胞的活性，并促使肿瘤浸润淋巴细胞的成熟；高剂量的重组 IL-2 和 IL-2 表达载体成功地消减了动物模型中的肿瘤。然而，毒性问题变得突出起来（ Toloza et al., 1996 ），后面的研究便集中于对其他细胞因子更为定向的递送，包括 IL-12 （ Bramson et al., 1996; Gambotto et al., 1999; Mazzolini et al., 2000; Siders et al., 1998 b ），有时候是与 IL-2 （ Addison et al., 1998 ）和肿瘤抗原（ Hirschowitz & Crystal, 1999 ）结合使用。将表达 IL-2 或 IL-12 的载体与表达淋巴细胞激活素（ lymphotactin ）的载体组合进行瘤内注射，在小鼠的乳腺癌模型系统中取得了成功（ Emtage et al., 1999 ）。意识到多种肿瘤会呈现肿瘤特异抗原这一点，激发了表达这些抗原的载体的使用，这类载体可以发挥促进抗肿瘤免疫反应的作用；由此进行了用表达 MART 1 或 gp100 的腺病毒载体治疗转移性黑色素瘤的试验（ Rosenberg et al., 1998 ）。这些结果证实了高剂量腺病毒载体的注射给药是安全的，但是针对载体出现的免疫反应却消除了长期的抗肿瘤效应。在一个结肠癌模型系统中（ Li et al., 1997 ），通过腺病毒载体表达的肿瘤抗原使肿瘤出现了明显地消减，并诱导了进一步的针对肿瘤的免疫反应。另一个前景很好的增强抗肿瘤免疫反应的途径是根据体内树突状细胞具有有效呈现抗原的能力。有人建议，一个有效的策略将是从病人体内分离出树突状细胞，用表达适当的肿瘤抗原的腺病毒载体来感染，将之改造并回输到病人体内，同时结合标准的疗法（ Crystal, 1999 ）。对人树突状细胞的研究显示，用腺病毒载体改造的树突状细胞其成熟度和功能不会受到影响（ Rea et al., 1999; Zhong et al., 1999 ），转移性肺癌的明显消减已经由鼠的树突状细胞而获得（ Wan et al., 1999 ）。一个黑色素瘤的鼠树突状细胞模型也通过腺病毒载体显示出显著的抗黑色素瘤免疫反应的增强（ Tuting et al., 1999 ）。使用双特异性抗体使病毒再定位于细胞表面的 CD40 受体上可以大幅度提高载体对树突状细胞的靶向特异性（ Tillman et al., 1999 ）。这一技术亦促进了细胞的成熟，因此增强了它们的免疫激活特性。表达 CD40 配体的载体可以直接导入肿瘤细胞内，并且在动物模型中促进了抗原呈递能力，使肿瘤消减（ Kikuchi & Crystal, 1999 ）。相关的其他策略涉及到粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子的载体表达（ Ozawa et al., 1999 ），以及增强树突状细胞对编码 TGF 1 （肿瘤生长因子 1 ）的载体的耐受性（ Lee et al., 1999 b ）。最近的研究显示，树突状细胞可以用与其自身 CAR 状态无关的载体来感染，而且这些细胞可以呈现出适当的 CTL （肿瘤特异性杀伤 T 淋巴细胞）效应（ Linette et al., 2000 ）。

遗传疾病的基因治疗

       囊性纤维化是一种相对普通的隐性遗传疾病，由 CFTR 基因突变造成，导致氯离子传导性降低，钠离子吸收率升高。由于这种缺陷在肺里表现得很明显，因此对肺有亲嗜性的腺病毒成为可选择的递送该疾病治疗基因的载体之一。然而，多种研究显示要成功地实现转基因表达还有很多障碍，其中之一是标准的 Ad2/5 载体不能感染高度分化的导气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞，这主要是由于 CARs 的缺乏（ Kaner et al., 1999; Pickles et al., 1998; Walters et al., 1999 ）。已尝试过用阳离子脂质体和磷酸钙共沉淀的方法来提高病毒的感染率（ Alton et al., 1999; Fasbender et al., 1997, 1998; Lee et al., 1999 a ）。一个更有希望的途径是构建带有 Ad17 （血清型）纤突的腺病毒嵌合体，这种方法提高了腺病毒与导气管上皮细胞的结合力（ Zabner et al., 1999 ）。阻碍转基因成功表达的另一个障碍是特异的肺相关 T 辅助细胞效应（ van Ginkel et al., 1997 ），新近的研究则显示了载体中 E4 基因的保留对于抵消这种袭击效应的重要性（ Armentano et al., 1997; Chirmule et al., 1998; Lusky et al., 1999; Yew et al., 1999 ）。更深一层的、天然的障碍是导气管上皮细胞可释放出具有抗腺病毒特性的抗菌多肽（ Gropp et al., 1999 ），而且，对支气管肺泡灌注液的研究显示除了中和性抗体外，还存在着腺病毒抑制因子（ Bastian & Bewig, 1999 ）。许多的这些因子可能可以解释早期腺病毒载体用于临床试验的结果，即，虽然转导效率得到证实，但整体的效率还是很低，转基因的表达时间相当短（ Zuckerman et al., 1999 ）。今后的载体能否提高转基因的表达效率和持续时间还有待于观察。  

    为了修复导致肌肉萎缩症的基因缺陷，大量地尝试了腺病毒载体的使用。在一个小鼠模型系统中，编码营养障碍基因（ dystrophin ）的载体可以递送到肌肉纤维中，使肌肉功能出现了一定程度的改善，但这只是暂时的，因为出现了抗载体和转基因的严重免疫反应（ Yang et al., 1998; Yuasa et al., 1998 ）。为了克服这一点而采取的措施包括使用改良的载体（ Kumar-Singh & Chamberlain, 1996 ）和使用 utrophin （ dystrophin 的同系物）（ Gilbert et al., 1999 ），这些尝试显示出了较好的转基因持久性。阻碍基因有效转导的障碍之一与细胞上缺乏所使用载体的受体相关，而带有多聚赖氨酸修饰的纤突的载体显著地促进了肌肉细胞对病毒载体的摄取（ Bouri et al., 1999 ）。已知肌肉纤维细胞中的免疫反应是由树突状细胞介导的，同时暗示 AAV 载体可能是递送转基因的更好的载体（ Jooss et al., 1998 c ）。一个犬模型系统也显示出免疫反应的重要影响，因为用腺病毒递送了 dystrophin 基因后再用环孢菌素治疗得到了更为持久的肌肉功能的改善（ Howell et al., 1998 ）。  

      已经构建了许多载体以减轻其他组织中的基因缺陷，在基因递送方面也遇到了类似的问题。

其他疗法

     随着高龄人口的增加，对于人神经退化疾病如帕金森氏病的治疗提出了一个重要的挑战。腺病毒，因其可以感染有丝分裂后的细胞，同时具有潜在的高转导效率和在中枢神经系统免疫特惠区（ immunologically privileged site ）中的低病原性，因此是进行神经疾病基因治疗的有效载体。已试验了两种传递治疗基因的主要策略。一个涉及到载体的脑内直接注射，另一个则是采用取出体内细胞在体外经由载体感染修饰后回输脑内相关区域的基因疗法（ ex vivo 基因疗法）（ Barkats et al., 1998 ）。神经母细胞（ neuroprogenitor ）（ Fisher, 1997 ）和人星型胶质细胞（ Ridet et al., 1999 ）明显可以作为自体同源的细胞载体用于 ex vivo 修饰和扩张（ expansion ）。使用四环素调节的腺病毒载体来表达酪氨酸羟基化酶（多巴胺合成途径中的限速酶）在若干动物模型中用 ex vivo 技术表现出了可观的前景（ Corti et al., 1999 a, b ）。在一次尝试用腺病毒缓解亨廷顿疾病的过程中，发现表达脑衍生神经营养因子（ BDNF ）的构建物在一个大鼠模型中显示出了令人充满希望的结果（ Bemelmans et al., 1999 ）。还有文献报道在腺病毒构建物中使用神经沉默基因成分来限制神经细胞内基因的表达（ Reference has been made above to the use of neuronal silencer elements I adenovirus constructs in restricting expression to neuronal cells ），这样做是期望这一策略能够避免转基因异位表达造成的副作用（ Millecamps et al., 1999 ）。  

    在过去的几年中，我们对于关节炎和细胞因子刺激炎症反应在关节和滑膜液中出现的过程有了更深的理解。一个主要的发现是 TNF （肿瘤坏死因子）在诱导类风湿性关节炎过程中所扮演的角色，由 TNF 抗体（ Maini et al., 1999 ）和 TNF 受体（ Franklin, 1999 ）成功进行了临床试验充分地说明了这一点。腺病毒载体在阐明某些细胞因子在这种疾病过程中的重要性和作用途径方面非常有用。如此，用腺病毒载体直接递送 TNF 受体和细胞因子 IL-1 在一个大鼠模型中在注射部位和远端部位都显示出了协同效应（ Ghivizzani et al., 1998 ）。类似的，在一个动物模型中， TNF 受体与表达 IL-10 的 EB 病毒显示出显著的协同效应（ Kim et al., 2000; Lechman et al., 1999 ）。表达 IL-4 载体的使用证明这种细胞因子能为软骨提供相当重要的保护以免发生炎症反应（ Lubberts et al., 1999 ）。相反的， IL-12 通过载体的递送却加速了疾病的进程（ Parks et al., 1998 ）。通过观察获得了重要的进展，即 NF-B 抑制物的载体表达抑制了巨噬细胞中 TNF 的产生（ Foxwell et al., 1998 ），而新近的研究显示 NF-B 的抑制作用伴随着致炎细胞因子的抑制作用，而不是伴随着主要的炎症介导物如 IL-10 的抑制（ Bondeson et al., 1999 a, b ）。这些结果由此精确地说明了 NF-B 在炎症中的重要作用，并指明了一个治疗的目标。然而，应该指出的是， TNF 的产生在某些细胞如单核细胞中并非依赖于 NF-B （ Hayes et al., 1999 ）。

其他用途

     腺病毒在生产多种蛋白以进行更为详细的分子间的作用分析方面是非常有用的载体，关于这一点，读者可以参见 Hitt et al. 所作的非常全面的综述（ 1997 ）。在美国军队中出现腺病毒引起的呼吸道疾病之后，腺病毒疫苗已经彻底地检查了其安全性（ Chanock et al., 1966 ），这促进了针对人免疫缺陷病毒（ Bruce et al., 1999 ）和狂犬病病毒（ Matthews et al., 1999; Yarosh et al., 1996 ）的重组腺病毒疫苗的研制发展。现有一篇对早期疫苗发展过程的综合性评述（ Graham & Prevec, 1992 ）。