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    基本方案 运用 AdEasy 方法产生重组腺病毒载体

    相关实验：腺病毒载体实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    感兴趣的基因
    具有卡那霉素抗性的 LB 培养基 限制性内切核酸酶 穿梭载体 DNA 乙酸铵 苯酚 氯仿 异戊醇 乙醇 电促感受态 BJ5183 细胞 感受态 DH10B 细胞 HBSS 或灭菌的 PBS
    铺有卡那霉素抗性的 LB 固体培养基皿 琼脂糖凝胶 脂质转染 AMINE 试剂 Opti-MEM I 培养基 锥形管

    步骤

    1•挑取可能含有感兴趣基因的候选克隆，接 种 于 2m l具卡那霉素抗性的液体培养基 内，由 15m l锥形管装载。置 于 37°C定轨摇床上扩大培养过夜。 2•使用任意标准的碱裂解法提取纯化质粒DNA。通过限制性内切核酸酶酶切分析和 (或）PC R 扩增证实转基因的存在和方向。 除 pAdEasy-1和-2是氨苄青霉素抗性以外，其余所有的穿梭载体和重组腺病毒 质粒都为卡那霉素抗性。 3•利用Pme I 或 Ecoi? 工限制酶酶切，线性化已证实的穿梭载体。为保证完全酶切，建 立 100^1 (0. 1〜0. 5^g DNA) 反应体系并加入5|u l的酶，以使本底降至最小化并 经琼脂糖凝胶证实是否酶切完全。 4•往100^1酶切反应后的体系中，加 人 IOOjlJ 双蒸水， IOOjlJ 7.5m〇 V L 乙酸铵以及2pl seeDNA (或以 2^1 20mg/ml 糖原代替） 。再加人 3(%1 25 : 24 : I (V/V/V ) 苯酚/ 氯仿/异戊醇， PH8.0 (附 录 3B)，提取DNA。 5•转移DNA溶液上层至一干净离心管内。再 加 入 GOOjbJ 1〇〇%乙醇， 16 〇〇〇 g■，室温， 离 心 5min。再加入7 0 % 乙醇清洗沉淀两次以消除残留的盐。 M 双蒸水重悬D N A 。’ 6 . 准备电促感受态BJ5183细胞，等分成20^1/管 ，保存于一80°C (支持方案3)。准备 转化时，将其解冻并置于冰上。 7. 往2〇4的感受态细胞内加入8.OjuI 的经PW I 酶切后的穿梭载体（ 来自第5 步）以 及 1. 0/』的 pAdEasy-1超螺旋腺病毒骨架载体（ loong/y )。最终体积限于< 3〇 iLj 。 8 . 小心转移细菌/D N A 的混合物至冰冷的2m m 电转杯内，避免产生气泡。并保持电转 杯置于冰水中。将 Bio-R ad 基因脉冲电转仪调至2500V , 20〇 n ， 25jliFD，并递呈 脉冲。 9•将转化的混合物重悬于5(%1 L B 培养基中。铺 于 3 或 4 个 LB/卡那皿， 37° C 培养 过夜。 在铺jni前 ，转化的细跑可先于37°C静止培育10〜20min。 10.挑 取 10〜20 个最小的单克隆，接种于2m l含 25^g/m l卡那霉素的液体培养基内， 置 37°C摇床上扩大培养1〇〜I 5h。
    行 闘 触 雛 麵 酬 分 能 赃 它 们 _ 始 结 构 最后 ^ 氯化铯结合法或，用商业提纯质粒的试剂盒提纯质粒，以备转染293细胞。 I 如，本底过_，可 考 細 下 的 料 方 法 。 Q 在电转后，^必再培育细菌的混合 物 ，而 是 直 接 铺 ② 尝 试 减 少 用 酶 切 消 化 的 穿 梭 质 粒 〇 ^^八量•③尽^ 使穿梭质粒产生缺口的可能性降至最低（ 如使用碱裂解法制备提取穿梭质粒） 。、 由于在BJ5183 细胞内，廣粒发生重组和重排的频率较高，故实验者就不应再 使用BJ5183细胞来培养候选的重组克隆，而应从Bj5183细胞内尽早地回收潜在的 重组，粒，且-旦确证，则应再将质粒转化至D H 1〇 B 或其他普通的菌株内，以供 质粒复制。 14.转染之前12〜20h ，将 293细胞以2X IO6个细胞/瓶的密度铺于i 个 或 2 个 25cm2 组织培养瓶中。 （ 在转染之时，细胞融合度应达到5〇%〜7〇%)。 15•转染当天，用 P ac I 酶切消化重组腺病毒质粒（ 大约4网 D p w 瓶） 。建 立 i 酶 切反应体系以确保酶切完全。用乙醇离心沉淀酶切消化后的质粒，加 入 2 〇 菌 水重悬质粒。 16•根据制造商的手册，进行标准脂质体转染。将 知 § 经户沉工酶切消化的质粒和2〇 [ 脂质转染A M I N E 试剂混合加入至已装有500jbj 〇pti_M E M I 培养基的 2 5 ^ 组 & 培养瓶中。将D N A /脂质转染A M I N E 试剂混合液室温静置I5〜3〇min 17. 当混合液静置之时，去除铺有293细胞的25cm2 组织培养瓶内的培养基轻轻加人 4m l 无血清培养基（ 如 纯 D M E M 或 H B S S 培养基）以洗除残留的含 血 清 基 。 然后再去除D M E M ，住母瓶25cm2组织； 1 ¾•养瓶内加入2.5ml Opti-MEM T ±立兼甚 放 回 37。 (：， 5% C 0 2 培养箱约l〇min。 〇 养基。 在清洗 2 9 3细胞时需特别谨慎，因为2 9 3细胞与瓶壁的黏附力往往较低 18. 往 25cm2组织培养瓶内逐滴加入D N A /脂质转染A M I N E 试 剂 混 合 = 户 苒 放回培养箱内。 ， J 口 丹 職 19. 4〜6h 后 ，去除含有D N A /脂质转染A M I N E 试剂混合液的培养基，妖；^加 人 7 1 新鲜的完整D M E M 。 如果发现大量的悬浮细胞，则不要更换含有D N A /脂质转染A M i n e 试剂混合 液 的 培 养 基 ，而是往瓶内加入6.〇1!11的完整〇]^£]^，再 放 回 培 养 箱 培 养 1〇〜 12^ 。 然后去除培养基，再向每瓶内加入7m l 新鲜的培养基。 2 0 . 如果使用的是pAdTrack-based载体，则可通过G F P 的表达，利用荧光显微镜监测 转染效率和病毒产物。已转染的细胞应置培养箱内持续培养1〇 〜12d。这 二
    无需更换培养基。 命 # / 又 ^ 说 ，直 到 转 染 后 两 个 星 期 ，显 微 镜 下 都 应 观 测 不 到 明 显 的 噬 斑 和 细 胞 病 二 ^ ，，， 1 染 后 5〜 7d ， 熒 光 显 微 镜 下 通 常 可 观 察 到 ⑶ ^ 斑 。 而 是 否 观 察 T , 3 = 4 斑 ，依 赖 于 转 染 效 率 。低 转 染 率 （1 0 % 〜 3 0 % ) 可 能 产 生 彗 星 样 ” 然 而 高 转 染 率 （ > 5 Q % ) 可 能 产 生 “散 射 星 状 ” 现 象 。 . 离心管内。 ，用细胞刮（ 不能使用胰酶消化）刮下细胞，并转移至5〇m丨锥形 、如果转染效率 较 低 （ < 30% ) ，更偏向于在转染15d后 收 获细胞， 以 保 证 理 想 的初始病毒滴度。这种情况下，在转染10d后 应 加 入 2ml新鲜培养基继续培 细胞。 22. 500心 代 离 心 细 胞 I0min，然后再用& 〇 miH B SS或灭菌P B S重悬细胞。 23•干冰/甲醇浴冷冻细胞， 3r c 水浴解冻以从细胞释放病毒。剧烈地旋转。再 重复冷 冻/解冻/旋 转 3 个循环。 一 旦解冻则迅速从水浴中移出管子以避免加温的病毒浮于 上层，否则会降低滴定率。 24. 500心 4°C短暂离心样品，使细胞碎片形成球形。 如果不立即用于感染，一2〇 。 〇或 一80°C保存病毒溶胞产物。 备 选 方 案 用 A dE asier细胞生产重组腺病毒质粒 在 Stmtagene公司可购买到多能AdEasier细 胞 （ 称 为 BJ5183-AEKL)。这对于只进 行少量腺病毒构造来说尤其方便。 附加材料（ 基本方案；标7 的条目参见附录1) pAdEasier-2 质 粒 （ Quantum Biotechnologies 或 Stratagene 的都可以） V L B 琼脂糖板含50jug/m l氨节青霉素、 30jug/m l链霉素 限制性内切核酸酶CHhd n 或 工 ） V L B 培养基，不含抗性 V L B 培养基，含25哗/〇11卡那霉素 1. 转 化 50hg pAdEasy-1或 pAdEasy-2质粒至电感受态的BJ5183细胞，条 件 如 下 （ 基 本方案，第 8 步)。 2. 将转化混合物（ 通 常 5 % 〜1 0 % ) 铺 至 含 5(V g/m I氨苄青霉素、 30jug/m l链霉素的 L B 琼脂糖板， 37°C培 养 15〜20h。 3. 挑 取 10〜20个克隆于2m l含氨苄青霉素、链霉素的L B 培养基， 37°C摇床培养过夜。 4 . 以任一个标准的碱裂解方法纯化各个克隆的质粒DNA。 5 . 限 制 酶 （ 拓/1(111或尸对I ) 消 化 2 0 % 〜3 0 % 小量制备的D N A 以确认质粒。选取一 个经确认的克隆（ 指定为AdEasier-1或 AdEasier-2)用于后续试验。 6. 准备电感受态AdEasier细胞，除用含氨苄青霉素、链霉素的L B 培养基外，方法见 支持方案3。 7 . 以 20^1/管储存电感受态AclEasier细胞，部分保存于一80°C ，可 保存6 个月。转化 时溶解一部分并置于冰上
    8.克隆基因至穿梭载体，用 P m e 工消化（ 见基本方案，第 1〜5 步） 。 9•每2〇4电感受态AdEasier细 胞 加 8^1用 I 消化的穿梭载体。限制终体积 为 30M 。 10•将细菌/D N A 混合物小心转移至冰镇的2m m 电穿孔杯，避免泡沫形成并将之置于 湿冰上。在 Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪上以2500V ， 20〇 n ， 25juFD的脉冲穿孔。 U •用5OOml L B 培养基重悬转化混合物。铺1〇%〜2 0 % 的转化混合物至1〜2 个 LB/卡 那板， 37°C 培养过夜（16〜20h)。 12.挑1〇〜20个最小的克隆，每个用2m l含 25!ug/m l 卡那霉素的L B 培养基37°C 旋转 培养10〜15h ，纯化、标记、重新生长质粒D N A ，见基本方案，第 11〜13步。 在 293包装系生产重组腺病毒方法如前所述（ 基本方案，第 14〜24步） 。 支持方案1 制备并纯化高滴定度腺病毒 大多数情况下，需要放大2〜4 个回合以达到大规模制备高滴定度腺病毒。然而回 合数主要决定于初级转染溶胞产物的初始滴定度。 附加材料（ 基本方案；标n /的条目参见附录1) 初级转染病毒上清（ 基本方案） CsCl 矿物油 氯漂白剂 V 2X 储存缓冲液 空白溶液：等体积混合的I.35g/ml CsCl与 2X 储存缓冲液 V T E 缓冲液，含 〇.i%SDS (见个别处方） 75cm2 组织培养瓶 Benchtop离心机 5 0 m l 圆锥离心管 Sorvall低温离心机，有 H S -4转子 12m l 异质同晶聚合物管用于S W u Ti转子 Beckman (或相当产品）超离心机，有 S W 4 1 Ti转子 站架、夹钳 3m l 吸管、 18G 注射针头 回 合 1 : 从 初 级 转 染 溶 胞 产 物 放 大 L 〜15h 8 0 % 〜 90■ 密 度 接 种 2 9 3 细 胞 至 25cm 2 组 织 培 养 瓶 （3 X 1〇6 个 细 胞 /瓶 含 6ml D M E M ) 。 2• 每 »卩 3 0 % 〜5〇% _级 转 染 病 毒 上 清 感 染 2w 组 织 培 养 瓶 中 挪 犠 = 染 时 初 级 转 染 溶 胞 产 物 的 用 量 主 要 决 定 于 其 初 始 滴 定 度 （ 通 常 为 i〇s〜 i〇8 感1 变 效 应 或 确 买 的 细 胞 裂 解 会 变 得 明 显 。 高 产 量 的 感 染 应 该 可 以 通 过 观 察 1 下 的 病 毒 溶 胞 产 物 储 存 于 一 赃 或 ― 80。 〇。 感 染 后 2 〜p A d T M
    based载 体 的 G F P 的 表 达 检 测到。 3. 在 3 0 % 〜5 0 % 的被感染细胞分离时（ 通常在感染后3〜5d) 刮下并收集细胞。 4. 转移刮下的细胞至15m l 圆锥离心管， 500心 代 离 心 l〇 m in。去上清， 5m i培养基 旋转重悬。 5 . 干冰/甲醇浴冷冻细胞， 37°C水浴解冻循环4 次以从细胞释放病毒。用清洁的溶胞产 物进行下一回合的放大或一80°C保 存 （ 可达一年） 。 回 合 2 和 3 : 中等规模的放大 6•感染前12〜15h 以 9 0 % 的密度接种293细胞至75c m2 组 织 培 养 瓶 （5 X 106〜7X 106 个细胞/瓶 含 16ml D M E M )。 7•每75c m2 组织培养瓶2阳个细胞加人2〜4m l 第 5 步制备的病毒溶胞产物。 37° C ， 5 % C O 2培养箱中培养。 8. 在 3 0 % 〜5 0 % 的被感染细胞分离时（ 通常在感染后2〜4d) 刮下并收集细胞。 9 . 转移刮下的细胞至50m l 圆锥离心管，在 benchtop临床离心机上500g ， 4°C离心 10m m 。 去上清液， IOml培养基旋转重悬。干冰/甲醇浴冷冻细胞， 37〇c 水浴解冻循 环 4 次以从细胞释放病毒。用清洁的溶胞产物进行下一 回 合 （ 第三回合）的放大或 一80°C保存。氯漂白剂灭毒含有病毒的废弃物。 10. 用 3〜5 个 75cm2 组织培养瓶重复第6〜9 步，进一步放大。收集被感染的细胞时， 用 25m l 灭菌的P B S 或 H B S S 重悬。冰冻/溶解3 或 4 个循环释放细胞中的病毒。用 清洁的溶胞产物进行下一回合的大规模的放大或一80°C 保存。 • 滴 定 度 可 以 随 时 测 定 ，在 有 pAdTrack-based时 更 容 易 。 用 不 同 浓 度 的 病 毒 上 清 感 染 2 9 3 细 胞 ， 18h 后 计 数 表 达 G F P 的 细 胞 数 。没 有 AdTrack病 毒 可 以 斑 点 滴 疋 （ 支持 方 案 2) 或 通 过 用 标 准 方 法 限 制 浓 度 来 滴 定 。放 大 3 回 合 后 ，病 毒 滴 度 应 该 达 到 每 毫 升 溶 胞 产 物 含 IO9〜101°个 感 染 颗 粒 （ 或 块 状 单 位 ） 。 回 合 4 : 大 规 模 放 大 以 及 C s C l 密度梯度离心纯化 11. 感染时9 0 % 〜1 0 0 % 的密度接种293细胞至15〜20个 75cm2 组织培养瓶（ IX lO 7 个细胞/瓶)。 12. 以 IOpfu/个细胞用病毒上清多重感染细胞。 13.当所有细胞变圆并且一半以上独立时（ 通常感染后3〜 ，从所有瓶中收获并混合 细胞， benchtop离 心 机 500g 离 心 5min，去上清。氯漂白剂灭毒含有病毒的废 弃物。 14. 8m l 灭菌P B S 重悬细胞团。干冰/甲醇浴冷冻细胞， 37°C 水浴解冻循环4 次以从细 胞释放病毒。低温离心机上7000心4°C 离心5min。 15. 称取4.蛣 CsCl于 50m l 圆锥离心管，转 移 8m l 清洁的病毒上清至里面（ 避免成 团） ，旋转充分混匀。 16•转移上述CsCl溶 液 （ 约 10ml， 1.35g/ml) 至一个12m l用于SW 41 Ti转子的异质 同晶聚合物管。以 2m l 矿物油覆盖填充该管子，准备一个平衡管， I76 000^ 1〇 ^ 超速离心18〜24h。
    和 15/xl空 白 溶 液 至 I0^ i T E /0.1 % S D S ，旋 转 3〇s, 离 心 5min，测 量 。 I O D 单 位 含 有 I0I2个 病 毒 颗 粒 /ml ( 颗 粒 ：感 染 颗 粒 =2〇 : D 。将 浓 缩 的 病 毒 f 种 储 存 于 - 8 0 C 最 好 ， 因 为 病 毒 颗 粒 在 高 盐 条 件 中 更 稳 定 。病 毒 原 种 在 体 外 高 度 稀 释 应 用 时 ’经 纯 化 的 病 毒 制 剂 可 以 直 接 用 。但 在 其 他 情 况 下 ， 由 于 CsCl 可 能 会 产 生 干 扰 或 产 生 细 胞 毒 性 ，最 好 在 应 用 之 前 立 即 去 盐 柱 或 琼 脂 糖 管 透 析 去 盐 （ 支持 方 案 5 ) 。 支持方案2 腺病毒板块分析 附 加 材 料 （ 基本方案；标V 的条目参见附录1) 腺病毒 2.8% (w /V ) Bacto 琼 脂 （ BectonDikinson) 2 X Basal Medium Eagle (B M E ； Life Technologies) lmol/L H E PES V I.Omol/L MgCl2 胎牛血清 100X 氨苄西林/链霉素溶液（ 如 Life Technologies) IOOX 中性红原料（ LifeTechnologies) 6 孔板 45°C水浴箱 1.以 5 0 % 〜7 0 % 的密度接种2 9 3 细胞至6 孔板_(2 X IO5〜5 X IO5 个细胞/孔 含 5ml D M E M ) 0 2. 在 10〜50W 体系中，根据腺病毒滴度确定一个合适的6 个 10倍稀释范围（ 通常为 1(T 3〜K T 81Ul/孔） 。 充分准备每个梯度的量，以备复杂的分析所需。 3. 去除每个孔中的上清，加人2m l D M E M 。将前面制备的6 个浓度的腺病毒分别加人 6 个孔中感染6〜16h。 每个孔都保留一个副本。 4 . 高压灭菌100ml 2. 8 % Bacto琼脂用作覆盖琼脂， 45°C水浴箱中保持温热。 5 . 如下制备I O O m l覆盖混合物（ 每 6 孔板需要25ml): 50. Oml 2X Basal M e d i u m Eagle (终浓度 I X ) ; 2. Oml lmol/L H E P E S (终浓度 20. O m m o l / L ) ; I. 25ml I. Omol/L M g C l 2 (终浓度 12. 5 m m o l / L ); 10. 0 胎牛血清（ 终浓度1〇%V A 〇; I.Oml 100X 氨苄青霉素/链霉素溶液（ 终浓度I X ); 充分混合，’ 37°C水浴箱中预热
    36ml 2. 8 % Bacto 琼 脂 （ 终浓度 1. 0%) 充分混合， 37°C 水浴箱中旋动。 6. 从孔中吸走D M E M ，沿着孔边沿慢慢地加入4m l 预热的覆盖混合物，注意不要移动 细胞。 7 . 室温下放置10〜20min，让覆盖混合物凝固。为避免覆盖混合物在板块形成以前凝 固，加灭菌的P B S 或 H B S S 至孔之间的空间，用塑料包裹物包裹6 孔板。置 于 37°C 培养。 8 . 第 5 天，在原有覆盖混合物上再加1.5m l每孔的覆盖混合物营养细胞并使其保持严 格的单细胞层。放回37°C培养。 . 9. 第 9 天，制备含中性红的覆盖混合物， 50m l 覆盖混合物中力口人5(%1 I O O X 中性红， 每孔2m l 此覆盖混合物覆盖。 10. 室温下放置lOmin，让覆盖混合物凝固。置 于 37°C 培养。 11. 12〜20h 后 ，取 出 6 孔板，灯下或光盒上从其底部观察单细胞层。计数每孔中的板 块数，板块为一个青灰色圆形区，中央有一个颜色更深的红橙色单细胞层。 12. 计算两套6 孔板每个梯度的板块平均数。这个平均数决定腺病毒原种的滴度，以板 块形成单位每毫升（ pfu/m D 表示。由于病毒编码G F P , 可通过在荧光显微镜下计 数 G F P 焦点数来确定感染性单位的滴度。 支持方案3 电能BJ5183细胞制备 附加材料（ 基本方案；标V 的条目参见附录1) 7 1 ^ 培 养 基 ，含链霉素301 ^/1111 10% (V /V ) 灭菌甘油，冰镇 lOng/jul pAdEasy-1 质粒 DNA J LB琼脂糖板，含氨苄青霉素50jug/ml 50m l 圆锥离心管 250m l 灭菌离心管， （ 用 于 I E C 离心机） I E C 离 心 机 （ 或相当） 1.5m l 微离心管， 一 80°C 预冷 1. 在 50m l圆锥离心管用新鲜BJ5183菌落或原种接种IOml含 3(Vg/ml链霉素L B 培养 基 ， 37°C摇床培养过夜。 2 . 取 I m l 上述细胞，接种至IOOOml含 30/xg/m l 链霉素L B 培养基中，通气良好下37°C 摇床剧烈振动培养4〜6h ，直到A 55 q达到0.8。 3. 收集细胞至4 个 250m l 灭菌离心管，冰上接种1〜3h (接种时间越长，其能力越大） ， 2600g ， 4°C 离心 lOmin。 4 . 去上清，重悬于IOOOml 1 0 % 冰镇的灭菌甘油以洗细胞团。将重悬的细胞以2500g ， 4°C 离 心 20min。重复洗一次。 5. 倒出大部分上清，然后用移液管轻轻的吸出残留的上清，每 个 250m l 灭菌离心管留 IOml左右。混合并转移细胞悬液至一 50m 丨离心管中， 2500g ， 4°C 离 心 l〇 min。
    6.去掉大部分上清，加4〇111110%冰镇的灭菌甘油重悬细胞， 250(^， 41：离心1〇1^11。 7•吸去上清，留 2m l 重悬细胞团。每个预冷的1.5m l 微离心管分装2(^1，保存于 ~80°C o 8.为验证其能力，加 入 L O juI lOng/jul的 pAdEasy- 1 质 粒 D N A 至2 〇4 制备好的 BJ5183 细胞。 . 9•转移细胞/DNA混合物至冰镇的2mm电转杯，在 Bio-Rad Gene Pulser上 以 2500V ， 2000, 25/iFD 进行电穿孔。 10. —个 50m l 圆锥离心管中，加 Iml L B 培养基至细胞， 37°C 摇床培养1〜2h。 11. 在 L B 培养基中配制100与 1000倍的细胞浓度。铺 IOOjuI各个浓度的细胞至含氨苄 青霉素50jug/m l 的 L B 琼脂糖板， 37°C 温箱中培养过夜（ 滴度应该大于108 克隆/^g DNA)。 支持方案4 腺病毒D N A 的制备 附 加 材 料 （ 见基本方案；标V 的条目参见附录1) 病毒溶胞产物或C s C l 密度梯度离心纯化病毒原种 1 0 % S D S 0 . 5 m o l / L E D T A 2 0 m g / m l P C R 级别蛋白酶 K (Life T e c h n o l o g i e s ) V 7. 5mol/仁乙酸亮丙瑞林铵 s e e D N A ( A m e r s h a m B i o s c i e n c e s ) P C - 8 ( F i s h e r ) 或 2 5 : 2 4 : I ( V / V A 0 苯酚/氯仿/异戊基乙醇（ 附录J 0 7 0 % 和 1 0 0 % 乙醇 5 5 ° C水浴箱 1 . 每 I O O j ^ l 病毒溶胞产物或I O ^ J C s C l 密度梯度离心纯化病毒原种，力卩 7//110% SDS， 3 4 0. 5mol/L E D T A ， 2〇4 20mg/ml蛋白酶K 。 充分混合，在 55°C水 浴 箱 温 浴 3hD 9 5 ° C 热 激 5 m i n 。 2 . 以去离子蒸溜水将病毒D N A 溶液总体积加至2004，然后加IOOjlJ 7. 5mol/L 乙酸亮 丙瑞林铵、 2 4 s e e D N A 。 3. 30〇4 PC-8抽提两次混合物。转移上相至一个新的I.5m l 微离心管，避免取到界面 物质。加 600|ul 100%乙醇。 4 . 以最大速度离心微离心管I O m i n , 使病毒D N A 沉淀。 7〇%乙醇洗两次， 5〇Jui 水溶解 病毒D N A 。 支持方案5 快速琼脂糖柱透析 材料 琼脂糖，分子生物学级 2m l 微离心管 200jul过滤器tip
    1.在微波炉最高温度下熔化琼脂糖与去离子蒸馏水混合物，制 备 1 % 的琼脂糖。 2•吸取I m l 熔化的琼脂糖至2m l 微离心管作一个透析柱装置。将一个斜削的吸头粘在 柱子的最底部。 3 . 室温下静止lh，取出吸头。加 50jul去离子蒸馏水在孔中，保持凝胶湿润。 4°C 保存 柱子。 4•透析时，去掉水，用注射针吸头加入病毒原种溶液.(一般小于25/iJ)。 5• —段 时 间 后 （ 通 常 10〜20min)，用注射针吸头去掉病毒原种溶液，可以直接使用， 如有必要可再重复透析一次。

    来源：丁香实验

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