制备感受态的技术心得

 

1：要注意每次做感受态要摇过也菌，最重要的是在摇菌的过程千万不要被污染。
2：其次是摇菌，要菌并不需要按照一定比例接，最重要的是收菌时候的OD600的值。这是极其重要的，也是很容易被大家忽略的问题，一般OD值达到0.42-0.48收菌是最好的。
其次是方法：
我做的方法是经过分子克隆上的INOUE法　我做的有一步和他的不同，而且是提高转化效率的主要关键，就是在最后一步是在菌液里加入０.１Ｍ氯化钙 　再加入甘油　终浓度为百分之１４ 进行保重，在这里我就不做详细介绍了

 

我最后一步就是用0.1M cacl2 重旋保种,
最近我做了连接转化的摸索实验,
判定1:将片段和载体共同放入37度水浴1min以上.
2:只将片段放入37度水浴1min以上,载体放再冰上,
这样连接出来的转化效率比平常要高4-6倍, 反映体系中最好是有水,先把水和连接酶,连接buffer加再一块,再把载体和片段放在一块,最后再把两种混合物加再一块. 最后还是16度连接.大概6个小时就ok啦哈!
这样做出来的连接转化率很高,虽然不知道阳性率有多少! 这也是我要下一步做的摸索,估计明天才会有结果.

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