农杆菌感受态的制备和转化

一、农杆菌感受态细胞的制备

1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃ 220rpm振荡培养至OD600=0.5。

4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。

6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。

7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

二、双元载体转化农杆菌EHA105

1. 取1 μg左右的质粒DNA加入到200 ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

2. 再在37℃水浴5min或42℃水浴1min。

3. 接着冰浴2min，加入800ml YM液体培养基。

4. 28℃，175rpm摇培3 hr后，涂在含50 μg/ml Kanamycin的YM平板上。

5. 28℃培养到形成单菌落。

注：其中 YM 可以用LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl₂   0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。