启动子克隆方法研究进展

2　讨论

　　以上介绍的几种方法基本代表了现有的启动子 克隆 方法，它们分别具有不同的特点和适用范围。

　　利用启动子探针载体筛选启动子时，不需要知道具体的基因序列，避免了引物设计，并能获得大量的启动子片段；其缺点是需要构建1个穿梭质粒，建库、转化、筛选，工作量大，费时费力，而且克隆、亚克隆的过程繁琐。因此在基因的遗传背景不是很清楚时，往往通过探针载体随机筛选启动子。

 

　　而PCR 法的主要优点是简便、快捷、操作简单；其缺点是只能扩增两端已知序列间的DNA 区，且扩增的特异性较低。其适用条件是建立在对基因序列十分清楚的基础上，只有知道基因的全序列，才可根据已知序列设计引物,扩增出该基因的启动子。因此，在基因序列清楚的情况下．我们首先想到的就是PCR 法。

　　I-PCR 法操作简单，克服了文库筛选、克隆、亚克隆的繁琐步骤，对实验条件要求不高，花费少，在PCR 法的基础上，增加了DNA 的环化过程，从而可以扩增只有一端序列已知的DNA ，由于不需要设计和合成大量昂贵的核苷酸接头，因此避免了引物设计和有接头而产生的非特异性产物的麻烦；然而由于直接克隆已知序列外的未知DNA 区域依赖于DNA 的环化性，而环化连接过程中常常产生多联体，成为副产物甚至是主要产物，导致非特异扩增，造成了闭环双链的DNA 的PCR 扩增效率差，经常得不到满意的结果，同时酶切片段太长也会使扩增效率下降。其适用于寻找只有一端序列已知的DNA ,对未知DNA 片段进行扩增。

　　相对于I-PCR ，P-PCR 经过设计形成的是锅柄状单链DNA 模板，从而有效增加了引物与模板结合的特异性，p-PCR 能够完成全部嵌套式扩增，因而产物有非常高的特异性；其缺点是也存在DNA 环化、连接的弊端，但与I-PCR 相比，其PCR 产物的特异性已大大增加。目前，P-PCR 可以扩增位于已知位点侧翼的大于3.0kb的人基因组DNA 的启动子，是目前为止能扩增距离已知序列最远的DNA 序列的方法．因而常用于扩增大片段的未知序列。

　　利用载体的PCR 克隆启动子有实验设计简便的优点，在基因组DNA 中加入含合适酶切位点的载体，是基于PCR 法的又一创新之处；然而其实验操作较为繁琐，特异性差，即使用套式PCR ，仍然有几条电泳 条带，因而特异性产物需杂交进一步确定。

　　利用接头的PCR 克隆启动子的优点是避免了DNA 环化，改进的接头可以通过形成锅柄结构有效抑制非特异性序列的扩增，但设计和合成大量的核苷酸接头，价格昂贵；此外用常规的加接头的方法来克隆启动子时往往有接头非特异产物产生，特异性较低，特异产物需杂交确定。由于利用接头的 PCR 法不需要 DNA 环化，通常适用于寻找已知c DNA 周围未知启动子或其它调控区域。

 

　　YADE法在利用接头PCR 时，巧妙地设计了“Y”型接头，从而有效地防止接头引物的单引物扩增，延伸时起始片段可以是基因组DNA 也可以是cDNA ．可用于复杂的基因组的PCR 步行，能广泛应用于真核生物；其缺点是成本较高，在应用YADE法时，为了得到合适的内切酶，需要从众多的内切酶中筛选，另外，特殊的接头往往也增加了实验的成本。通常对于较复杂的真核生物基因组可以采用YADE法。

　　目前理想的启动子克隆方法需要更为广泛的，不需要PCR 前的酶切、环化等操作，且特异性较高的PCR 技术，TAIL-PCR 基本符合这一条件。TAIL-PCR 法的有以下优点：(1)方法简单，只要设计好引物，即可用基因组DNA 为模板直接进行PCR 扩增；(2)特异性高，用简并引物和特异性嵌套引物相组合，通过不对称的温度循环和分级反应，使最终的目的片段占绝对优势；(3)高效灵敏，使用任何一个AD引物，在60％～80％的反应中能产生特异性产物；(4)快速，整个反应可在ld内完成，(5)避免了DNA 的环化和连接，反应产物准确可靠，重复性好。TAIL～PCR 的创新之处在于其热不对称的分级反应，有效防止了非特异产物的扩增；但是TAIL～PCR 仍有很多不尽人意的地方：TAIL～PCR 反应需要较多的引物组合；此外，由于随机简并引物存在有限的结合位点，对个别侧翼序列，即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果，整个反应需要一系列连续反应，条件设置要求精细；还要求引物和模板有较高的纯度，如果有降解或纯度不够，也很难扩增出特异性条带；此外，TAlL～PCR 还很有可能扩增的是高度重复序列，因而无法步行。TAIL～PCR 技术适合于分离获得克隆载体上的DNA 序列，达到克隆相关基因的启动子的目的，也可用于基因组小的物种，如拟南芥和基因组大的物种，如小麦的已知序列两侧翼的DNA 序列的分离。

　3　展望

　　目前，启动子 克隆 的方法种类繁多，进展迅速。启动子 克隆 方法绝大多数是建立在 PCR 的基础上的染色体步行技术，因而利用启动子 克隆 的方法不仅可以 克隆 到基因的启动子，同时还可以用于 克隆 c DNA 的全长。分子生物学的一个重要问题是如何利用大量积累的基因部分序列(如EST)进一步 克隆 全长基因及其调控序列，而启动子 克隆 方法为这一问题提供了简便有效的手段。另外，随着基因工程的发展，出现了越来越多的转基因动植物，启动子 克隆 的方法也可以应用在转基因生物的研究中，如转基因水稻的T－ DNA 区，通过启动子 克隆 方法的 PCR 步行技术，能成功地 克隆 到T－ DNA 区的旁侧序列，有助于分析突变体中突变区序列。

　　随着PCR 技术的不断进步，一定会有更多、更好的克隆启动子的方法产生，而它们最后也将会是克隆基因全长或突变体(特别是转座子插入突变体)中目的基因的简便高效的新方法。　　

    注：
    （1）参考文献：略；需者可与本站Email联系，或到中国水稻研究所图书馆查阅；
    （2）文章来源：中国生物工程杂志，2005年25卷第7期；
    （3）作者单位：黑龙江大学生命科学学院 等。