启动子克隆方法研究进展

　1.3　环状

PCR

　　环状PCR 包括I-PCR (Inverse-PCR )和P-PCR (Panhandle-PCR )。这2种PCR 都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR 。

　　1.3.1　I-PCR I-PCR 是1988年由Triglia最早提出的一种基于PCR 的改进的染色体步行方法。

I-PCR 的实验程序包括，基因组DNA 经酶切后用T4DNA 连接酶进行自连接，产生环状DNA 片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行PCR 扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物(流程如图1所示)。

　　韩志勇等以I-PCR 技术为基础克隆了转基因水稻的外源基因旁侧序列。先用小量法提取转基因水稻的总DNA ，总DNA 用10倍过量的限制内切酶进行过夜酶切，酶切片段进行自连接，然后根据工程质粒的T-DNA 区设计2对反向引物，进行套式PCR 扩增旁侧序列。建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序列的技术体系。在1周内克隆了35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在300～750bp之间。I-PCR 法快速、高效、稳定，操作相对简单，花费少，PCR 引物设计比较方便。

　　1.3.2　P-PCR P-PCR 是由Jones等提出的利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板，有效增强了引物与模板结合的特异性。反应需要3个根据已知序列设计的引物，3个引物在已知序列内呈线性排列，其中第3个引物可作为接头使用，可与已知序列互补配对形成锅柄状单链模板。其过程为，首先酶切基因组DNA ，产生5'或3'粘末端，然后连接上合适的接头(primer 3)，连接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接头，由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列，变性后的DNA 单链可退火形成锅柄状单链模板，之后分别用3个单引物进行3次PCR 扩增，能有效地扩增2～9kbp的大片段未知序列(流程如图2所示)。

　　黄君健等成功地应用P-PCR 技术从正常的人外周血单核细胞基因组DNA 中扩增端粒催化亚基hTERT基因5'端上游旁侧序列，获得了hTERT基因翻译启始位点上游2090bp的基因组DNA 序列。首先用酶切消化基因组DNA ，得到带有GATC的5'突出端的DNA 片段。然后利用已知的hTERTcDNA 序列设计PCR 引物，用常规的PCR 方法扩增出1条大约900bp的基因组特异片段，序列分析为hTERT的基因组DNA 片段。根据得到的基因组DNA 序列的信息，确定P-PCR 的引物退火区，并合成了5'磷酸化的连接寡核苷酸和4条基因特异性引物，其中连接寡核苷酸5'端的4个碱基CTAG与上述核酸内切酶消化产生的5'突出端GATC互补，然后将连接寡核苷酸与基因组酶切产物连接，以连接产物为反应模板，进行PCR ，使模板自身进行退 火-延伸反应，以形成Panhandle结构。最后以单链Panhandle为模板，4条基因特异序列为引物进行嵌套式PCR ，最终获得了1条约2kb的含hTERT基因启动子的DNA 片段。Jones等利用改进的P-PCR ，在形成panhandle结构之前3'末端连上ddCTP，使引物错配的机率减少，特异性增加。他们从人类基因组