常规杂交反应存在的问题

 

　

　　常规杂交反应由于受到探针解链温度、溶液中靶序列的初始浓度及探针长度的影响。样品中不同探针所对应的靶序列的拷贝数不尽相同，探针的解链温度也难以保持一致，这样不同位点的杂交速度并不完全与各自靶序列的拷贝数成正比，检测结果也就不具有良好的平行性。所以必需选择最理想的条件以尽可能使正确配对的序列不被遗漏，并使杂交错配降到最低。DNA双链进行杂交配对时，A:T间形成2个氢键而G:C间形成3个氢键，所以同样长度的探针由于G+C含量的差异而具有不同的解链温度，这样杂交的动力学就会有差别。以TMAC作为溶剂可以平衡AT与GC的杂交结合能，因而可在一个杂交条件下获得比较理想的杂交效果[1,2]。例如，Honore等人将PCR扩增得到的探针与尼龙膜固定后在3M的TMAC溶液中与标记的高度简并的寡聚核苷酸进行杂交反应。在这种条件下，Tm将与G+C含量无关而只决定于探针的长度。而且发现，掺入脱氧次黄苷(deoxyinosine, I)的寡核苷酸探针在比Tm值低10℃的条件下可以进行良好的杂交[3]。Oh等用15nt长的探针以SSOP(sequence-specific oligonucleotide probe，序列特异的寡核苷酸探针)方法同一温度下在TMAC溶液中对HLA-A进行杂交分型，一次性可以检测到30个通过等电聚焦技术鉴定的类型[4]。杂交后的DNA芯片在严谨条件下洗涤以去除未杂交的残留核酸样品。但这种常规杂交方式在速度、灵敏度和特异性等方面都阻碍了整个芯片的杂交效果。因为，探针必需具有相似的解链温度，这样才能保证杂交条件的一致性。杂交反应与溶液中靶序列的初始浓度成正比，所以必需提高靶DNA的浓度以加快反应速度。

[参考文献]

1. Bains W. Selection of oligonucleotide probes and experimental conditions for mμltiplex hybridization experiments. Genet Anal Tech Appl, 1994;11(3):49-62.

2. Honore B, Madsen P. The tetramethylammonium chloride (TMAC) method for screening cDNA libraries with highly degenerate oligonucleotide probes obtained by reverse translation of amino acid sequences. Methods Mol Biol, 1997;69:139-46.

3. Honore B, Madsen P, Leffers H. The tetramethylammonium chloride method for screening of cDNA libraries using highly degenerate oligonucleotides obtained by backtranslation of amino-acid sequences. J Biochem Biophys Methods,1993; 27(1):39-48.

4. Oh SH, Fleischhauer K, Yang SY. Isoelectric focusing subtypes of HLA-A can be defined by oligonucleotide typing. Tissue Antigens 1993 Mar;41(3):135-42.