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姐妹染色单体分化染色方法

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姐妹染色单体差别染色可使中期染色体显示深浅不同的两条单体,能借以观察姐妹染色单体互换(SCE)现象。SCE是两条染色单体在DNA合成中核苷酸序列发生互换而表现出来一种现象。即是细胞分裂是DNA同源重组的结果。SCE既是一种无害的变化(有生理波动),也可受射线、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映细胞的损伤与修复状态。
 
1.  原理:
 
在细胞培养过程中,加入一定是的5-溴脱氧尿苷(BudR ),当细胞在DNA复制过程时,BudR能作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶而被掺入到新合DNA中。因此,当细胞处于第二个分裂周期时,同一染色体的两条姐妹染色单体,一条由双股都含有BudR的DNA链构成,而另一条为单股含有BudR的DNA链。在结构上双股含BudR的DNA螺旋化程度较低,故对染色剂亲合力低,在用Giemsa染色时其单体着色浅,只有单股含BudR的DNA链组成的单体则着色深而形成差别着色。
 
2.  BudR贮存液的配制:
 
BudR 5 mg(先用0.5 ml 1 N NaOH溶解)
 
然后加蒸馏水至 5 ml
 
即成1000 ug/ml的贮存液,因BudR遇光会发生分解,贮存液需置棕色瓶并黑纸封瓶避光冰冻保存。
 
3.  实验材料:
 
所检培养细胞;
 
BudR贮存液;
 
2×SSC液;
 
常规染色体制片所需物品;
 
水浴锅;
 
20W紫外灯一个;
 
培养皿;
 
镜头纸;
 
4.  操作程序
 
(1)BudR掺入:细胞培养24小时后于培养液中加入BudR,最终浓度5-15 mg/ml,避光条件下继续培养。
 
(2)终止培养:待细胞经历两个细胞周期(48小时),培养终止前3小时加秋水仙素,秋水仙素终浓度为0.02 ug/ml培养液;
 
(3)常规制片及烤片;
 
(4)紫外灯照射:取标本玻片置于大号培养皿内,正面朝上,上覆盖镜头纸,从玻片外镜头纸边沿加2×SSC液致使全镜头纸浸湿,移入50-60 ℃水浴锅内,紫外线灯距离5 cm,照射30-40分钟;
 
(5)染色:取出照射后标本,蒸馏水冲洗,置PH6.8的2%Giemsa染色15分钟;
 
(6)洗片及存片:同G带片
 
注意:BudR是一种强突变剂,使用浓度不宜过高,否则会产生细胞毒性作用。
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