姐妹染色单体分化染色

1. 实验原理　姐妹染色单体分化染色法(Sister chromatid differentiation，SCD)是20世纪70年代中期发展起来的染色体处理技术。1973年Latt在培养的细胞中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromode Oxyurdine，BrdU），用Hoechst 33258 荧光染料染色时，发现了姐妹染色单体的色差反应和它们之间互换的现象。1974年KO Renberg和Froeed-Lender改进了这一技术，用Giemsa染色。SCD形成原理（图13-2）是：在细胞培养过程中，加入5-溴脱氧尿苷，当细胞的DNA复制时，Brdu可作为核苷酸前体物专一取代胸腺嘧啶而被掺入到新合成DNA链中。第二周期加入BrdU，每条新合成的染色单体DNA双链中旧模板没有掺入，半保留复制的新链被BUdR掺入；当细胞处于第三个分裂周期时，同一染色体的两条姐妹染色单体，一条由双股都含有BrdU的DNA链构成，而另一条为单股含有BrdU的DNA链。在结构上双股含BrdU的DNA螺旋化程度降低，故对染色剂亲和力低，在用Giemsa染色时着色浅，只有单股含BrdU的DNA链组成的单体则着色深而形成差别着色。应用姐妹染色单体区分染色法研究来自一个染色体的两条单体之间在同一个位点发生同源片段的交换，称为姐妹染色单体互换（sister chromotid exchange,SCE）。SCE是两条染色单体核苷酸序列发生互换而表现出来的一种现象。

图 13-2

这种技术用于研究细胞周期、染色体半保留复制、染色体的分子结构和畸变，以及DNA的复制、损伤与修复等一系列重要理论问题。由于SCE能灵敏地检测染色体的变化，表现出剂量-效应关系，还可以将姐妹染色单体互换频率列为检测致突变物、致癌物的常规指标之一。

2. 实验对象　所检培养细胞。

3. 实验试剂与器材

（1）BrdU贮存液的配制：BrdU 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解）然后加蒸馏水至 5ml即成1000μg/ml的贮存液，因BrdU遇光会发生分解，贮存液需置棕色瓶并黑纸封瓶避光冰冻保存；

（2）2×SSC液，水浴锅，20W紫外灯一个，培养皿，镜头纸。

4. 实验方法与步骤

（1）Brdu掺入：细胞培养24h后于培养液中加入Brdu，最终浓度10μg/ml，避光条件下继续培养。

（2）待细胞经历两个细胞周期（48h），培养终止前4h加秋水仙素，秋水仙素终浓度为0.02μg/ml培养液；

（3）常规制片，染色体制片在 37℃ 恒温箱内老化24h；

（4）紫外灯照射：取标本玻片置于大号培养皿内，正面朝上，上覆盖镜头纸，从玻片外镜头纸边沿加2×SSC液致使全镜头纸浸湿，移入 60℃ 水浴锅内，紫外线灯距离 5cm ，照射30min；

（5）染色：取出照射后标本，蒸馏水冲洗，置pH6.8的2%Giemsa染色10min。

5. 注意事项

（1）BrdU是一种强突变剂，使用浓度不宜过高，否则会产生细胞毒性作用。

（2）影响SCE的因素：地区与环境，Brdu的浓度，动物的种类，染色体长度，培养时间与温度。