姐妹染色单体交换实验

姐妹染色单体交换（sister chromatid exchange，SCE）是指同一条染色体复制过程中形成的两条染色单体之间所发生的一类特殊的同源重组。SCE 发生的机制尚不清楚，但其发生的频率可以反映细胞在 DNA 合成期的受损程度。

姐妹染色单体交换实验的基本原理是5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸（5-homodeoxyuridine，5-BrdU）是脱氧胸腺嘧啶核苷的类似物。

当人体外周血淋巴细胞在含有 5-BrdU 的培养液中增殖时，5-BrdU 可取代胸腺嘧啶掺入到新复制成的 DN A子链中。经过两个复制周期后，其中期染色体的两个单体的 DNA 双链在化学组成上便出现了差别，即一条 DNA 的双链均有 BrdU 掺入，而另一条 DNA 双链中仅有一条链有 BrdU 掺入。

利用特殊的分化染色技术对染色体标本进行处理，可使双链均含有 BrdU 掺入的染色单体浅染，而只有一条链掺入 BrdU 的染色单体深染。所以当姐妹染色单体之间存在同源片段交换时，在互换处可见界限明显、颜色深浅对称的交换片段。

器材：

① 光学显微镜

② 恒温培养箱

③ 恒温水浴

④ 采血器材

⑤ 酒精灯

⑥ 培养瓶

⑦ 乳头吸管

⑧ 载玻片

⑨ 20 W 紫外线灯

⑩ 染色缸

⑪ 9 cm 培养皿

⑫ 人外周静脉血。

试剂：

② 植物血凝素（PHA）

③ 秋水仙素（100 μg/mL）

④ 5-BrdU（100 μg/mL）

⑤ 低渗液（0.075 mol/L KCI 溶液）

⑥ 2 x SSC

⑦ 吉姆萨原液

⑧ 磷酸缓冲液（pH6.8）

⑨ 甲醇

⑩ 冰醋酸

姐妹染色单体交换实验的基本过程可分为如下几步：

A 按半微量法采取外周静脉血，接种 0.5 mL 到含有 PHA 的 GI-1640 培养液（5 mL）中，置 37 ℃ 恒温培养箱培养。

B培养 24 h 后，往培养瓶中加入 5-BrdU（终浓度为 10 μg/mL），轻轻混匀。

C 用黑纸包裹培养瓶，置 37 ℃ 恒温培养箱避光培养 48 h。

D 收获前加入秋水仙素（终浓度为 0.2 μg/mL），继续培养 2 h。

E 常规方法制片（见基本方案 1、染色体标本制备），将制好的染色体玻片标本置室温放置 2～3 d。

F 分化染色前一天，将染色体玻片标本置 37 ℃ 过夜。

G 在 9 cm 培养皿中平行放置两根牙签，将老化好的染色体玻片标本放在牙签上，然后加入适量 2 x SSC 溶液（以不超过标本为度）。

H 在标本上盖一张比玻片略宽的擦镜纸，使纸边浸入 2 x SSC 溶液中，并使2 x SSC 溶液渗至染色体玻片标本上，保持标本湿润。

I 将培养皿置 55 ℃ 水浴箱支架上，只使培养皿底部接触水面。

J 用 20 W 紫外灯垂直照射标本 30 min，照射距离 10 cm。

K 照射后，用镊子轻轻揭去擦镜纸，用蒸馏水轻轻冲洗染色体玻片标本。

L 用 4％ 吉姆萨染液（用 pH6.8 磷酸缓冲液配制，使用前 20 min 配好）染色 5~10 min。

M 用蒸馏水轻轻冲洗染色体玻片标本，空气干燥。

1 5-BrdU 应现用现配，4 ℃ 避光保存。

2 视野中可见处于不同增殖周期的分裂相。处于第一增殖周期的染色体由于每条染色单体的 DNA 双链中都只有一股掺入 5-BrdU，两条姐妹染色单体着色均为深染；而进入第三增殖周期的分裂相中，染色体的每条单体中 DNA 双链均掺入 5-BrdU，两条染色单体均为浅染。以上两种分裂相均不宜作 SCE 观察和计数。应选择处于第二增殖周期的分裂相，即每条染色体的两条染色单体出现差别着色的分裂相进行观察。