原理
细胞被培养在含有 5-溴脱氧尿苷（5-Bromodeoxyuridine：BUdR）的培养基中，当细胞在DNA 合成时，BUdR 能作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶核苷（Thymidine：TdR）被掺入到新合成的DNA中。
在第一个细胞周期时，由于半保留复制的机制，中期染色体的每条染色单体DNA双链都被掺入了BUdR（TB·TB）。
但在第二个周期时，在化学组成上便发生了差别：中期染色单体的两条染色单体中只有一条单体保留了半数无BUdR的旧链，而另一条单体的双链都含有BUdR（TB·BB），当用二苯并咪唑衍生物荧光染料Hoechst 33258染色时，TB链能发出较强荧光，BB链对荧光有淬灭作用发弱光。
由于Hoechst 33258荧光染色消失速度很快，继而人们建立了观察SCD的永久标本法。
其中常用有热磷酸盐处理加Giemsa染色和荧光染料加Giemsa染色（FPG）。
TB链与Giemsa染料亲和力强，与BB链亲和力差，得到结果和用荧光染料染色相一致的、形成深浅不同的差别染色。
在第一个细胞周期时，由于半保留复制的机制，中期染色体的每条染色单体DNA双链都被掺入了BUdR（TB·TB）。
但在第二个周期时，在化学组成上便发生了差别：中期染色单体的两条染色单体中只有一条单体保留了半数无BUdR的旧链，而另一条单体的双链都含有BUdR（TB·BB），当用二苯并咪唑衍生物荧光染料Hoechst 33258染色时，TB链能发出较强荧光，BB链对荧光有淬灭作用发弱光。
由于Hoechst 33258荧光染色消失速度很快，继而人们建立了观察SCD的永久标本法。
其中常用有热磷酸盐处理加Giemsa染色和荧光染料加Giemsa染色（FPG）。
TB链与Giemsa染料亲和力强，与BB链亲和力差，得到结果和用荧光染料染色相一致的、形成深浅不同的差别染色。
材料与仪器
细胞 标本
BUdR NaOH 秋水仙素 NaH2PO4 Giemsa Sorensen SSC
BUdR NaOH 秋水仙素 NaH2PO4 Giemsa Sorensen SSC
步骤
一、BUdR 贮存液的制备
二、BUdR 掺入和制片程序
2. BUdR 掺入
如用传代细胞，在末次传代后，改换用含BUdR的培养液培养；如为人末梢血细胞，一开始就用含BUdR培养液培养（培养瓶放在特制黑色木盒、黑布中或用黑纸包裹）37 ℃温箱内培养；
3. 中止掺入与制片
待细胞经历两个细胞周期（人周围血细胞培养48或72 小时）；
4. 加秋水仙素→制片（与其它染色体制备法相同）。
三、姐妹染色单体分化染色
1. 方法一
（1）老化
中期染色体标本老化1～2 天；
2. 方法二（FPG 法）
（1）标本
掺入BUdR后的中期染色体标本；
（3）黑光灯照射
自来水冲洗、加1 滴pH 8.0 Sorensen缓冲液，覆以盖片，用黑光灯照射（20w），距离5 厘米，时间半小时；
（4）温浴
50～60 ℃热的2×SSC 液温育2 小时，蒸馏水冲洗、晾干；
3. 方法三
（1）标本
掺入BUdR后的中期染色体标本，置30 瓦日光灯下，灯距3 厘米，照射6 小时；
（2）温浴
用2×SSC 液（60 ℃）处理15 分钟；
此外还有其它一些分化染色法，但较复杂，不常使用。上述分化染色法中以方法二效果较好。
BUdR 5 mg（先用0.5 ml 1 N NaOH 溶解），然后补加蒸馏水至5 ml，即成1000 μg/ml的贮存液，因BUdR遇光会发生分解，贮存液应避光冰冻保存。
二、BUdR 掺入和制片程序
1. BUdR 培养液制备
先制备好含BUdR的培养液（最终浓度为3~10 μg/m）；
先制备好含BUdR的培养液（最终浓度为3~10 μg/m）；
2. BUdR 掺入
如用传代细胞，在末次传代后，改换用含BUdR的培养液培养；如为人末梢血细胞，一开始就用含BUdR培养液培养（培养瓶放在特制黑色木盒、黑布中或用黑纸包裹）37 ℃温箱内培养；
3. 中止掺入与制片
待细胞经历两个细胞周期（人周围血细胞培养48或72 小时）；
4. 加秋水仙素→制片（与其它染色体制备法相同）。
三、姐妹染色单体分化染色
1. 方法一
（1）老化
中期染色体标本老化1～2 天；
（2）预处理
放入预热至85～89 ℃的1 M NaH2PO4溶液中（用NaOH调pH至8.0）处理15 分钟；
放入预热至85～89 ℃的1 M NaH2PO4溶液中（用NaOH调pH至8.0）处理15 分钟；
（3）制片
然后用温蒸溜水轻轻漂洗、蒸馏水冲洗、晾干、Giemsa液染色10 分钟、晾干、二甲苯透明、封固。
然后用温蒸溜水轻轻漂洗、蒸馏水冲洗、晾干、Giemsa液染色10 分钟、晾干、二甲苯透明、封固。
2. 方法二（FPG 法）
（1）标本
掺入BUdR后的中期染色体标本；
（2）荧光染色
用荧光染料Hoechst 33258（用pH7.0 Sorensen缓冲液配制，浓度为0.5 μg/ml）染色12～15 分钟；
用荧光染料Hoechst 33258（用pH7.0 Sorensen缓冲液配制，浓度为0.5 μg/ml）染色12～15 分钟；
（3）黑光灯照射
自来水冲洗、加1 滴pH 8.0 Sorensen缓冲液，覆以盖片，用黑光灯照射（20w），距离5 厘米，时间半小时；
（4）温浴
50～60 ℃热的2×SSC 液温育2 小时，蒸馏水冲洗、晾干；
（5）染色
pH 6.8 的2 %Giemsa染色15 分钟、透明封固。
pH 6.8 的2 %Giemsa染色15 分钟、透明封固。
3. 方法三
（1）标本
掺入BUdR后的中期染色体标本，置30 瓦日光灯下，灯距3 厘米，照射6 小时；
（2）温浴
用2×SSC 液（60 ℃）处理15 分钟；
（3）Giemsa染色10 分钟，也可获得满意的标本。
此外还有其它一些分化染色法，但较复杂，不常使用。上述分化染色法中以方法二效果较好。
注意事项
1. BUdR是一种强突变剂，使用浓度不宜太高，否则会产生细胞毒性；浓度达每ml·30 μg 时，SCE数目能明显升高；
2. 方法一中，标本温育时间与老化时间的长短有关，老化时间越长，温育时间也要延长。
2. 方法一中，标本温育时间与老化时间的长短有关，老化时间越长，温育时间也要延长。
常见问题
来源：丁香实验
