姐妹染色单体互换标本制备法

一、实验目的
通过实验，掌握姐妹染色单体分染技术。
二、实验原理
姐妹染色单体交换是近年来细胞遗传学研究的一个新方法。其原理是，当细胞接触到5－溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)时，Brdu可作为核苷酸前体物，专一替代胸腺嘧啶掺入到新合成的DNA链中。只要通过两个细胞复制周期，就可使姐妹染色单体中的一条单体的DNA双链中，有一股链是掺入有Brdu的，而另一条单体的DNA双链中，两股链全掺入有Brdu.这样的细胞经过分化染色处理，即可见到同一条染色体的两条姐妹染色单体有明显的差异,有一条单体为深色,另一条为浅色。
三、实验材料
体重为20～30克左右的纯小白鼠，蚕豆种子。
四、实验器具和药品 试剂
显微镜、冰箱、水浴锅、天平、离心机、剪刀、镊子、注射器、吸管、离心管、载片、量筒、烧杯、紫外灯、大培养皿。
秋水仙素 、5－溴脱氧尿苷、液体石蜡、柠檬酸钠、氯化钾、2×SSC溶液、磷酸缓冲液、盐酸、Giemsa 原液。
五、实验方法和步骤
(一)动物实验法
1．称100mg Brdu用5ml液体石蜡在小烧杯内混匀，冰箱保存备用。
2．用2ml注射器（8号针头）吸取药液，按每克体重注射1mg的量注入小鼠右腋皮下或腹腔内。
3．注射56小时后，按5ug/克的量注射秋水仙素溶液。
4．4小时后处死动物，取出大腿骨和胫骨。
5．按“小白鼠染色体的制备与观察”实验的方法制备染色体标本。
6．将染色体标本放入37℃温箱内处理24小时。
7．在恒温水浴锅（48℃）内放一大培养皿，把标本片分放在皿内，上复一张擦镜纸，滴加适量的2×SSC溶液，用15W紫外灯照射30分钟，灯管距离标本片约6厘米。
8．照射完毕以蒸馏水或磷酸缓冲液冲去标本上的2×SSC溶液。
9．用3％Giemsa 染液染色10分钟。
10．清水冲洗，片干后镜检。
(二)植物实验法
1．选取当年的蚕豆种子，经水泡胀后，转入20℃温箱培养。 当主根长至3cm时，剪去根尖生长点，以利于长出更多的侧根。
2．当大多数侧根长至0.5cm时，用盛有5×10-4M Brdu溶液的小瓶，继续在20℃黑暗条件下处理侧根24～36小时。
3．切取侧根根尖(0.5cm)浸入0.05％的秋水仙素溶液中预处理3.5～4小时。
4．用卡诺氏液固定3～24小时。
5．将根尖放在1N HCL 60℃条件下水解10分钟。
6．经水洗后用席夫 试剂 染色30分钟。
7．取一着色的根尖，放在载片上，加一滴45％醋酸，盖上盖片，用镊子或橡皮头铅笔将材料敲呈一薄雾状。
8．选择分散的中期分裂相细胞，在高倍镜下可看到姐妹染色单体间呈现明显的深浅差别。深染的是BB－染色单体，浅染的是BT－染色单体。部分染色体上出现姐妹染色单体互换。凡染色单体端部出现的交换计为1个SCE，中部出现的计为两个SCE。