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G418筛选稳定表达细胞系

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常见问题和解答:

Q :我觉得套环法操作不如 96 孔办法效率高。

A : 也不一定 . 依据实验目的与要求而定 . 如果克隆效率较低的细胞 , 套环可能更好 . 用 96 孔板法 , 如果不是每孔单个细胞 , 就不能保证是单克隆 . 即使是增加到每孔十几个细胞或上百个 , 一个 96 孔板也只能培养一万个细胞 , 十万个细胞就至少需要 10 个板 ,100 万个细胞就需要 100 个板 , 对于转基因细胞筛选或基因打靶 , 工作量就太大了 . 且细胞在单独生长条件下 , 远远不如千万个细胞共同培养活力好 . 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞 , 有限细胞系还是无限细胞系 , 转基因还是非转基因 , 筛选还是不筛选 , 需要的单细胞克隆株数量多少 ?


 

Q : 请问一种细胞如果转染了稳定表达的,含 neo 抗性基因的质粒后,如何用 G418 筛选?我查看了国内、外 50 几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为,从理论上讲,如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定?维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系?

A : 1. G418 筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至 1000cell/ml ,每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板,将每孔中的 G418 浓度稀释至 0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml 等1 2 个级别 , 培养 10-14 天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般 400- 800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。 
2。我们掌握是传过 10 代以后用维持量,但不能不用,因为有时候抗性基因会丢失,如果没有 G418 ,很快会形成优势的。 
3。即是有 G418 抗性,也不一定有目的基因,单克隆化操作是很重要的。


 

Q :请问:能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗?

A :转染后,每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的,目的蛋白表达有的多,有的少,外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小,所以生长较快,在生长若干代之后,表达少的细胞会形成优势,长期之后,表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要,转绿色荧光蛋白基因后,表达越来越暗就是这个道理。所以,要进行单克隆化操作,使得到的均来自于同一祖先细胞,遗传性状尽量一致,也是对高表达细胞的保护。操作用 96 孔板法,每代细胞长满后,大多数冻存,留200 cell 左右就可以进行该操作了,该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述,我就不赘述了。

必须指出,单克隆化要做几遍,一遍是不够的,我前十代都是这样的,结果绿色荧光蛋白不但没减弱,反而增强了很多。现在很多代了,很稳定。


 

       Q : 1 。我的质粒中含有 SV40 与 neo 基因,好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。 
2 。按您的讲法,筛选要进行 10 代,那么维持剂量要进行多长时间?如果我使用对照组 , 在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗? 
3 。在细胞用胰酶进行传代时,此时细胞膜受到一定影响,如果培养基中存在 G418 对细胞是否有影响? 
4 。既然细胞表达 neo, 从理论上讲是否无论多大浓度的 G418 对之都无影响?

A : 1. 可以肯定的是,外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的,这点我们做过 FISH 验证过,表达量与整合数目,上游序列特性,特定部位 DNA 立体结构都是相关的,装入了 SV40 只是增加了表达了数目,但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法,转染完 GFP 的细胞应该亮度一致,但实际上差别很大。 neo 基因也是这样,而且,同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同,不同细胞同一基因的数目也不会相同,这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时, neo 表达了,但目的基因丢失了的情况也是有的。 
2。那为什么还要筛选基因?是这样,用概率论的思维来理解,某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因,那么,一种基因拷贝数为 0 的可能性,及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小,很大的概率为外源基因的不均质。打个比方,一个大口袋,抓100个红球,再抓 100 个黄球,然后以从中抓若干个,这些球均为红球的概率有多大呢?应该是很小的。红球就是 neo ,黄球就是你的目的基因。我们用 neo ,实际上是筛选的外源基因整合的数目,怎么说呢?用刚才的例子来说,如果我们抓着5个红球,另一次抓着10个红球,可以肯定,的二次抓的球比较多,那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。

3。维持就是只要养这种细胞,就要维持。可以再低些,但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下,我不知你是否干临床,想想抗生素的用药原则,反向思维一下,实际上我们在筛选耐药株呀。

4。 neo 的产物是酶,过高的 G 418浓度就要有更多的 neo 酶来支持,否则细胞也要被毒死的,而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担,细胞可能因此无法完成分裂与增殖,我们曾试过,即使在同一转染阳性细胞,在不同浓度的 G418 液中生长速度也不同,严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛,这回不用数论的,用米氏方程理解吧。 
5。胰酶的作用不必理会,有的细胞受影响,还有的细胞不受影响,由几代之后,不受影响的细胞会占优势的。 
    仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理,实在是个人经验,而且在基础科学领域顶多算票友,我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。

Another answer:


1. 外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关,如果整合发生在活性转录染色质区,则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的,所以为了获得高表达细胞株,需要对重组克隆进行筛选。某些载体如 pcDNA3 包含SV40 的复制起始位点,可以是质粒在反式提供大 T 抗原的细胞系中复制,增强瞬时表达,有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说,即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合,表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。 
2。关于概率论的思维,我认为红球和黄球的比喻很形象,但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁,并不是完全相互独立的。

Q : G418 怎么配制?

A :我觉得不能用水配,因为这样 PH 会变化很大,至少要用 PBS 。我是配在 HEPES 溶液中的,具体方法如下: 1g 包装的 G418 瓶子中,加入 10ml HEPES 溶液,浓度为 100 mg/ml 完全溶解后, 0.22 um 过滤,- 20 度保存。 HEPES 缓冲液配方如下: 90 ml 水中, 0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖, 0.5 g HEPES, 溶解,NaOH 调 PH 至 7.05, 定容至 100ml 。

Good answer:


推荐用 HEPES 。特别是当细胞对 G418 不敏感, G418 使用浓度高时,如果用水、 PBS 配置,会极大的改变细胞培养基的 pH 值,影响细胞的生长。 1mol/L HEPES 的简单配置: HEPES 11.91g ,溶解于 40ml 的 ddH2O ,用 10mol/L 的NaOH 调节 pH 至 7.5-8.0 ,定容至 50ml , 0.22um 小滤器过滤。 HEPES 最终使用浓度 15-20mM 。


 

Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的 G418 直接加进培养瓶直接筛选,这样做可以吗?我做过 G418 杀伤曲线, 300ug\ml 就基本上可以杀死细胞,我想直接用 1000ug\ml 来筛选,不知是否可行?会不会有什么问题?

A: G418 筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至 1000cell/ml ,每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板,将每孔中的G418 浓度稀释至 0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml 等1 2 个级别 , 培养 10-14 天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般 400- 800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。

G418 浓度太高也不好,会对细胞的损伤太大,影响增殖。我用过 Zeocin ,为了加速筛选,用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到,欲速则不达。


 

Q: 我用 24 孔板做了 G418 筛选的浓度梯度,确定最低致死浓度为 600mg/l 。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞,我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢?在这期间可以换液吗?筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中是否还应该加一定浓度的 G418 ?如果要加的话什么浓度比较合适?

A: 应该保持这个浓度 9 天以上,每 3 天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中应该加一定浓度的 G418 ,一般在最低致死浓度的 60% 左右。


 

Q: 在 6 孔板里进行 NIH3T3 细胞转染后的 G418 筛选, 2 周后单克隆形成,于是就挑取单克隆,之前 6 孔板里的细胞很多,用 0.125%typsin+0.25%EDTA 消化, 1000 转 / 分离心 10 分钟 ,肉眼可以 看到细胞沉淀,接种至 25ml 塑料培养瓶中,镜下看密度可以,但是细胞形态成多态性:少量是圆形,大多数是梭形。第 2 天一看没有细胞贴壁!做了 2 次都这样,请问我的操作步骤有问题吗?

A: 看了你的操作步骤,个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆,在 6 孔板里用 G418 筛选两周后只是大部分细胞死亡,少数细胞存活并逐渐生长,只能叫作克隆形成。 
我们一般在转染后 24h 将细胞消化下来( 0.25%trypsin + 0.02%EDTA ),以 1 : 10 或更高的比例传代,贴壁 24h 后加选择性培养基开始筛选。待大部分细胞死亡,极少数细胞渐形成克隆。再把这些克隆经 24 孔板、 6 孔板放大后再进行单克隆化的操作(具体操作方法见附件)。从严格意义上来讲,单克隆化的操作一般要进行 2-3 次,经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外,在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔,否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象,也可以在消化完用正常培养基,待细胞贴壁后再换为含 G418 的培养基。还有,在多克隆形成后一定要及时冻存,以备后续试验。 
你挑选的克隆,不能贴壁原因可能有二 ; 一、细胞很少,那么你接种后,由于密度较低,细胞是接触生长,所以密度太低,细胞难以生存。二、拟消化下来可能用 G418 筛选液筛选,这样也会死亡。消化后先用无 G418 的培养液培养,贴壁后,再换取 G428 培养液。


 

Q: 我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来,书上说用弯头吸管,我试了,不好用,根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来,我想着用刮勺,但进口的特别贵,所需又不多,你看有什么别的好办法吗?谢谢了!

A: 如何挑选克隆。你可以按以下操作方法进行: 
【操作方法】 
( 1 )将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置,并将各个克隆位置用标记笔标记准确; 
( 2 )在超净台内,弃去培养皿内的培养液; 
( 3 )用镊子夹取一块滤纸块,用 0.25%Trypsin 消化液浸湿,置于所标记克隆位置处, 5-20 秒;(有人可提前在一孔中装入 0.02%EDTA PBS ) 
( 4 )将 24 孔培养板每孔加 G418 选择培养基 2ml ,用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快,置于一个孔中的培养基中,涮洗滤纸块数次,以使黏附的细胞脱落下。镜下观察确认细胞已经脱落后,将滤纸块取出弃掉,其它克隆方法转移同上;(有人在细胞贴壁后再选用培养基) 
( 5 )将移有克隆细胞的 24 孔培养板,继续置 37 ℃ 5%CO2 培养箱培养, 2-5 天; 
( 6 )待细胞长满后, 0.25%Trypsin 消化液消化,并将细胞转移至 6 孔板继续培养,或转入多瓶中扩增,此后可做进一步鉴定工作。


 

Q: 用 G418 做 HEp-2 细胞的建系已经有 2 个月了,已经在细胞瓶中扩大培养,但发现与正常 HEp-2 细胞相比,建系的细胞生长得很慢,细胞间的边界也不是很清楚,而且细胞长得不均匀,这样正常吗?为改变这一状态,我该怎么做呢?谢谢!

A: 基本算正常吧。稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化,有的很明显,比如说细胞变大,生长缓慢,细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等;有的则变化不明显。对于稳定转染的细胞,建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复,因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担,细胞较倾向于甩掉负担轻装前进,这一点对于肿瘤细胞尤甚;另一方面,如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话,这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。在传代过程中,也可以使用正常培养基,但过一段时间一定要用维持剂量的含 G418 的培养基压一压,以除去回复的细胞。


 
常见问题和解答:

Q :我觉得套环法操作不如 96 孔办法效率高。

A : 也不一定 . 依据实验目的与要求而定 . 如果克隆效率较低的细胞 , 套环可能更好 . 用 96 孔板法 , 如果不是每孔单个细胞 , 就不能保证是单克隆 . 即使是增加到每孔十几个细胞或上百个 , 一个 96 孔板也只能培养一万个细胞 , 十万个细胞就至少需要 10 个板 ,100 万个细胞就需要 100 个板 , 对于转基因细胞筛选或基因打靶 , 工作量就太大了 . 且细胞在单独生长条件下 , 远远不如千万个细胞共同培养活力好 . 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞 , 有限细胞系还是无限细胞系 , 转基因还是非转基因 , 筛选还是不筛选 , 需要的单细胞克隆株数量多少 ?


 

Q : 请问一种细胞如果转染了稳定表达的,含 neo 抗性基因的质粒后,如何用 G418 筛选?我查看了国内、外 50 几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为,从理论上讲,如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定?维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系?

A : 1. G418 筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至 1000cell/ml ,每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板,将每孔中的 G418 浓度稀释至 0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml 等1 2 个级别 , 培养 10-14 天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般 400- 800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。 
2。我们掌握是传过 10 代以后用维持量,但不能不用,因为有时候抗性基因会丢失,如果没有 G418 ,很快会形成优势的。 
3。即是有 G418 抗性,也不一定有目的基因,单克隆化操作是很重要的。


 

Q :请问:能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗?

A :转染后,每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的,目的蛋白表达有的多,有的少,外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小,所以生长较快,在生长若干代之后,表达少的细胞会形成优势,长期之后,表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要,转绿色荧光蛋白基因后,表达越来越暗就是这个道理。所以,要进行单克隆化操作,使得到的均来自于同一祖先细胞,遗传性状尽量一致,也是对高表达细胞的保护。操作用 96 孔板法,每代细胞长满后,大多数冻存,留200 cell 左右就可以进行该操作了,该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述,我就不赘述了。

必须指出,单克隆化要做几遍,一遍是不够的,我前十代都是这样的,结果绿色荧光蛋白不但没减弱,反而增强了很多。现在很多代了,很稳定。


 

       Q : 1 。我的质粒中含有 SV40 与 neo 基因,好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。 
2 。按您的讲法,筛选要进行 10 代,那么维持剂量要进行多长时间?如果我使用对照组 , 在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗? 
3 。在细胞用胰酶进行传代时,此时细胞膜受到一定影响,如果培养基中存在 G418 对细胞是否有影响? 
4 。既然细胞表达 neo, 从理论上讲是否无论多大浓度的 G418 对之都无影响?

A : 1. 可以肯定的是,外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的,这点我们做过 FISH 验证过,表达量与整合数目,上游序列特性,特定部位 DNA 立体结构都是相关的,装入了 SV40 只是增加了表达了数目,但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法,转染完 GFP 的细胞应该亮度一致,但实际上差别很大。 neo 基因也是这样,而且,同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同,不同细胞同一基因的数目也不会相同,这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时, neo 表达了,但目的基因丢失了的情况也是有的。 
2。那为什么还要筛选基因?是这样,用概率论的思维来理解,某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因,那么,一种基因拷贝数为 0 的可能性,及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小,很大的概率为外源基因的不均质。打个比方,一个大口袋,抓100个红球,再抓 100 个黄球,然后以从中抓若干个,这些球均为红球的概率有多大呢?应该是很小的。红球就是 neo ,黄球就是你的目的基因。我们用 neo ,实际上是筛选的外源基因整合的数目,怎么说呢?用刚才的例子来说,如果我们抓着5个红球,另一次抓着10个红球,可以肯定,的二次抓的球比较多,那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。

3。维持就是只要养这种细胞,就要维持。可以再低些,但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下,我不知你是否干临床,想想抗生素的用药原则,反向思维一下,实际上我们在筛选耐药株呀。

4。 neo 的产物是酶,过高的 G 418浓度就要有更多的 neo 酶来支持,否则细胞也要被毒死的,而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担,细胞可能因此无法完成分裂与增殖,我们曾试过,即使在同一转染阳性细胞,在不同浓度的 G418 液中生长速度也不同,严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛,这回不用数论的,用米氏方程理解吧。 
5。胰酶的作用不必理会,有的细胞受影响,还有的细胞不受影响,由几代之后,不受影响的细胞会占优势的。 
    仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理,实在是个人经验,而且在基础科学领域顶多算票友,我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。

Another answer:


1. 外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关,如果整合发生在活性转录染色质区,则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的,所以为了获得高表达细胞株,需要对重组克隆进行筛选。某些载体如 pcDNA3 包含SV40 的复制起始位点,可以是质粒在反式提供大 T 抗原的细胞系中复制,增强瞬时表达,有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说,即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合,表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。 
2。关于概率论的思维,我认为红球和黄球的比喻很形象,但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁,并不是完全相互独立的。

Q : G418 怎么配制?

A :我觉得不能用水配,因为这样 PH 会变化很大,至少要用 PBS 。我是配在 HEPES 溶液中的,具体方法如下: 1g 包装的 G418 瓶子中,加入 10ml HEPES 溶液,浓度为 100 mg/ml 完全溶解后, 0.22 um 过滤,- 20 度保存。 HEPES 缓冲液配方如下: 90 ml 水中, 0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖, 0.5 g HEPES, 溶解,NaOH 调 PH 至 7.05, 定容至 100ml 。

Good answer:


推荐用 HEPES 。特别是当细胞对 G418 不敏感, G418 使用浓度高时,如果用水、 PBS 配置,会极大的改变细胞培养基的 pH 值,影响细胞的生长。 1mol/L HEPES 的简单配置: HEPES 11.91g ,溶解于 40ml 的 ddH2O ,用 10mol/L 的NaOH 调节 pH 至 7.5-8.0 ,定容至 50ml , 0.22um 小滤器过滤。 HEPES 最终使用浓度 15-20mM 。


 

Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的 G418 直接加进培养瓶直接筛选,这样做可以吗?我做过 G418 杀伤曲线, 300ug\ml 就基本上可以杀死细胞,我想直接用 1000ug\ml 来筛选,不知是否可行?会不会有什么问题?

A: G418 筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至 1000cell/ml ,每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板,将每孔中的G418 浓度稀释至 0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml 等1 2 个级别 , 培养 10-14 天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般 400- 800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。

G418 浓度太高也不好,会对细胞的损伤太大,影响增殖。我用过 Zeocin ,为了加速筛选,用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到,欲速则不达。


 

Q: 我用 24 孔板做了 G418 筛选的浓度梯度,确定最低致死浓度为 600mg/l 。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞,我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢?在这期间可以换液吗?筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中是否还应该加一定浓度的 G418 ?如果要加的话什么浓度比较合适?

A: 应该保持这个浓度 9 天以上,每 3 天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中应该加一定浓度的 G418 ,一般在最低致死浓度的 60% 左右。


 

Q: 在 6 孔板里进行 NIH3T3 细胞转染后的 G418 筛选, 2 周后单克隆形成,于是就挑取单克隆,之前 6 孔板里的细胞很多,用 0.125%typsin+0.25%EDTA 消化, 1000 转 / 分离心 10 分钟 ,肉眼可以 看到细胞沉淀,接种至 25ml 塑料培养瓶中,镜下看密度可以,但是细胞形态成多态性:少量是圆形,大多数是梭形。第 2 天一看没有细胞贴壁!做了 2 次都这样,请问我的操作步骤有问题吗?

A: 看了你的操作步骤,个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆,在 6 孔板里用 G418 筛选两周后只是大部分细胞死亡,少数细胞存活并逐渐生长,只能叫作克隆形成。 
我们一般在转染后 24h 将细胞消化下来( 0.25%trypsin + 0.02%EDTA ),以 1 : 10 或更高的比例传代,贴壁 24h 后加选择性培养基开始筛选。待大部分细胞死亡,极少数细胞渐形成克隆。再把这些克隆经 24 孔板、 6 孔板放大后再进行单克隆化的操作(具体操作方法见附件)。从严格意义上来讲,单克隆化的操作一般要进行 2-3 次,经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外,在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔,否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象,也可以在消化完用正常培养基,待细胞贴壁后再换为含 G418 的培养基。还有,在多克隆形成后一定要及时冻存,以备后续试验。 
你挑选的克隆,不能贴壁原因可能有二 ; 一、细胞很少,那么你接种后,由于密度较低,细胞是接触生长,所以密度太低,细胞难以生存。二、拟消化下来可能用 G418 筛选液筛选,这样也会死亡。消化后先用无 G418 的培养液培养,贴壁后,再换取 G428 培养液。


 

Q: 我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来,书上说用弯头吸管,我试了,不好用,根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来,我想着用刮勺,但进口的特别贵,所需又不多,你看有什么别的好办法吗?谢谢了!

A: 如何挑选克隆。你可以按以下操作方法进行: 
【操作方法】 
( 1 )将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置,并将各个克隆位置用标记笔标记准确; 
( 2 )在超净台内,弃去培养皿内的培养液; 
( 3 )用镊子夹取一块滤纸块,用 0.25%Trypsin 消化液浸湿,置于所标记克隆位置处, 5-20 秒;(有人可提前在一孔中装入 0.02%EDTA PBS ) 
( 4 )将 24 孔培养板每孔加 G418 选择培养基 2ml ,用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快,置于一个孔中的培养基中,涮洗滤纸块数次,以使黏附的细胞脱落下。镜下观察确认细胞已经脱落后,将滤纸块取出弃掉,其它克隆方法转移同上;(有人在细胞贴壁后再选用培养基) 
( 5 )将移有克隆细胞的 24 孔培养板,继续置 37 ℃ 5%CO2 培养箱培养, 2-5 天; 
( 6 )待细胞长满后, 0.25%Trypsin 消化液消化,并将细胞转移至 6 孔板继续培养,或转入多瓶中扩增,此后可做进一步鉴定工作。


 

Q: 用 G418 做 HEp-2 细胞的建系已经有 2 个月了,已经在细胞瓶中扩大培养,但发现与正常 HEp-2 细胞相比,建系的细胞生长得很慢,细胞间的边界也不是很清楚,而且细胞长得不均匀,这样正常吗?为改变这一状态,我该怎么做呢?谢谢!

A: 基本算正常吧。稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化,有的很明显,比如说细胞变大,生长缓慢,细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等;有的则变化不明显。对于稳定转染的细胞,建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复,因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担,细胞较倾向于甩掉负担轻装前进,这一点对于肿瘤细胞尤甚;另一方面,如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话,这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。在传代过程中,也可以使用正常培养基,但过一段时间一定要用维持剂量的含 G418 的培养基压一压,以除去回复的细胞。


 
常见问题和解答:

Q :我觉得套环法操作不如 96 孔办法效率高。

A : 也不一定 . 依据实验目的与要求而定 . 如果克隆效率较低的细胞 , 套环可能更好 . 用 96 孔板法 , 如果不是每孔单个细胞 , 就不能保证是单克隆 . 即使是增加到每孔十几个细胞或上百个 , 一个 96 孔板也只能培养一万个细胞 , 十万个细胞就至少需要 10 个板 ,100 万个细胞就需要 100 个板 , 对于转基因细胞筛选或基因打靶 , 工作量就太大了 . 且细胞在单独生长条件下 , 远远不如千万个细胞共同培养活力好 . 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞 , 有限细胞系还是无限细胞系 , 转基因还是非转基因 , 筛选还是不筛选 , 需要的单细胞克隆株数量多少 ?


 

Q : 请问一种细胞如果转染了稳定表达的,含 neo 抗性基因的质粒后,如何用 G418 筛选?我查看了国内、外 50 几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为,从理论上讲,如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定?维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系?

A : 1. G418 筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至 1000cell/ml ,每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板,将每孔中的 G418 浓度稀释至 0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml 等1 2 个级别 , 培养 10-14 天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般 400- 800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。 
2。我们掌握是传过 10 代以后用维持量,但不能不用,因为有时候抗性基因会丢失,如果没有 G418 ,很快会形成优势的。 
3。即是有 G418 抗性,也不一定有目的基因,单克隆化操作是很重要的。


 

Q :请问:能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗?

A :转染后,每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的,目的蛋白表达有的多,有的少,外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小,所以生长较快,在生长若干代之后,表达少的细胞会形成优势,长期之后,表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要,转绿色荧光蛋白基因后,表达越来越暗就是这个道理。所以,要进行单克隆化操作,使得到的均来自于同一祖先细胞,遗传性状尽量一致,也是对高表达细胞的保护。操作用 96 孔板法,每代细胞长满后,大多数冻存,留200 cell 左右就可以进行该操作了,该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述,我就不赘述了。

必须指出,单克隆化要做几遍,一遍是不够的,我前十代都是这样的,结果绿色荧光蛋白不但没减弱,反而增强了很多。现在很多代了,很稳定。


 

       Q : 1 。我的质粒中含有 SV40 与 neo 基因,好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。 
2 。按您的讲法,筛选要进行 10 代,那么维持剂量要进行多长时间?如果我使用对照组 , 在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗? 
3 。在细胞用胰酶进行传代时,此时细胞膜受到一定影响,如果培养基中存在 G418 对细胞是否有影响? 
4 。既然细胞表达 neo, 从理论上讲是否无论多大浓度的 G418 对之都无影响?

A : 1. 可以肯定的是,外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的,这点我们做过 FISH 验证过,表达量与整合数目,上游序列特性,特定部位 DNA 立体结构都是相关的,装入了 SV40 只是增加了表达了数目,但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法,转染完 GFP 的细胞应该亮度一致,但实际上差别很大。 neo 基因也是这样,而且,同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同,不同细胞同一基因的数目也不会相同,这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时, neo 表达了,但目的基因丢失了的情况也是有的。 
2。那为什么还要筛选基因?是这样,用概率论的思维来理解,某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因,那么,一种基因拷贝数为 0 的可能性,及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小,很大的概率为外源基因的不均质。打个比方,一个大口袋,抓100个红球,再抓 100 个黄球,然后以从中抓若干个,这些球均为红球的概率有多大呢?应该是很小的。红球就是 neo ,黄球就是你的目的基因。我们用 neo ,实际上是筛选的外源基因整合的数目,怎么说呢?用刚才的例子来说,如果我们抓着5个红球,另一次抓着10个红球,可以肯定,的二次抓的球比较多,那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。

3。维持就是只要养这种细胞,就要维持。可以再低些,但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下,我不知你是否干临床,想想抗生素的用药原则,反向思维一下,实际上我们在筛选耐药株呀。

4。 neo 的产物是酶,过高的 G 418浓度就要有更多的 neo 酶来支持,否则细胞也要被毒死的,而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担,细胞可能因此无法完成分裂与增殖,我们曾试过,即使在同一转染阳性细胞,在不同浓度的 G418 液中生长速度也不同,严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛,这回不用数论的,用米氏方程理解吧。 
5。胰酶的作用不必理会,有的细胞受影响,还有的细胞不受影响,由几代之后,不受影响的细胞会占优势的。 
    仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理,实在是个人经验,而且在基础科学领域顶多算票友,我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。

Another answer:


1. 外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关,如果整合发生在活性转录染色质区,则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的,所以为了获得高表达细胞株,需要对重组克隆进行筛选。某些载体如 pcDNA3 包含SV40 的复制起始位点,可以是质粒在反式提供大 T 抗原的细胞系中复制,增强瞬时表达,有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说,即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合,表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。 
2。关于概率论的思维,我认为红球和黄球的比喻很形象,但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁,并不是完全相互独立的。

Q : G418 怎么配制?

A :我觉得不能用水配,因为这样 PH 会变化很大,至少要用 PBS 。我是配在 HEPES 溶液中的,具体方法如下: 1g 包装的 G418 瓶子中,加入 10ml HEPES 溶液,浓度为 100 mg/ml 完全溶解后, 0.22 um 过滤,- 20 度保存。 HEPES 缓冲液配方如下: 90 ml 水中, 0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖, 0.5 g HEPES, 溶解,NaOH 调 PH 至 7.05, 定容至 100ml 。

Good answer:


推荐用 HEPES 。特别是当细胞对 G418 不敏感, G418 使用浓度高时,如果用水、 PBS 配置,会极大的改变细胞培养基的 pH 值,影响细胞的生长。 1mol/L HEPES 的简单配置: HEPES 11.91g ,溶解于 40ml 的 ddH2O ,用 10mol/L 的NaOH 调节 pH 至 7.5-8.0 ,定容至 50ml , 0.22um 小滤器过滤。 HEPES 最终使用浓度 15-20mM 。


 

Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的 G418 直接加进培养瓶直接筛选,这样做可以吗?我做过 G418 杀伤曲线, 300ug\ml 就基本上可以杀死细胞,我想直接用 1000ug\ml 来筛选,不知是否可行?会不会有什么问题?

A: G418 筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至 1000cell/ml ,每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板,将每孔中的G418 浓度稀释至 0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml 等1 2 个级别 , 培养 10-14 天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般 400- 800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。

G418 浓度太高也不好,会对细胞的损伤太大,影响增殖。我用过 Zeocin ,为了加速筛选,用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到,欲速则不达。


 

Q: 我用 24 孔板做了 G418 筛选的浓度梯度,确定最低致死浓度为 600mg/l 。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞,我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢?在这期间可以换液吗?筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中是否还应该加一定浓度的 G418 ?如果要加的话什么浓度比较合适?

A: 应该保持这个浓度 9 天以上,每 3 天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中应该加一定浓度的 G418 ,一般在最低致死浓度的 60% 左右。


 

Q: 在 6 孔板里进行 NIH3T3 细胞转染后的 G418 筛选, 2 周后单克隆形成,于是就挑取单克隆,之前 6 孔板里的细胞很多,用 0.125%typsin+0.25%EDTA 消化, 1000 转 / 分离心 10 分钟 ,肉眼可以 看到细胞沉淀,接种至 25ml 塑料培养瓶中,镜下看密度可以,但是细胞形态成多态性:少量是圆形,大多数是梭形。第 2 天一看没有细胞贴壁!做了 2 次都这样,请问我的操作步骤有问题吗?

A: 看了你的操作步骤,个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆,在 6 孔板里用 G418 筛选两周后只是大部分细胞死亡,少数细胞存活并逐渐生长,只能叫作克隆形成。 
我们一般在转染后 24h 将细胞消化下来( 0.25%trypsin + 0.02%EDTA ),以 1 : 10 或更高的比例传代,贴壁 24h 后加选择性培养基开始筛选。待大部分细胞死亡,极少数细胞渐形成克隆。再把这些克隆经 24 孔板、 6 孔板放大后再进行单克隆化的操作(具体操作方法见附件)。从严格意义上来讲,单克隆化的操作一般要进行 2-3 次,经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外,在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔,否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象,也可以在消化完用正常培养基,待细胞贴壁后再换为含 G418 的培养基。还有,在多克隆形成后一定要及时冻存,以备后续试验。 
你挑选的克隆,不能贴壁原因可能有二 ; 一、细胞很少,那么你接种后,由于密度较低,细胞是接触生长,所以密度太低,细胞难以生存。二、拟消化下来可能用 G418 筛选液筛选,这样也会死亡。消化后先用无 G418 的培养液培养,贴壁后,再换取 G428 培养液。


 

Q: 我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来,书上说用弯头吸管,我试了,不好用,根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来,我想着用刮勺,但进口的特别贵,所需又不多,你看有什么别的好办法吗?谢谢了!

A: 如何挑选克隆。你可以按以下操作方法进行: 
【操作方法】 
( 1 )将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置,并将各个克隆位置用标记笔标记准确; 
( 2 )在超净台内,弃去培养皿内的培养液; 
( 3 )用镊子夹取一块滤纸块,用 0.25%Trypsin 消化液浸湿,置于所标记克隆位置处, 5-20 秒;(有人可提前在一孔中装入 0.02%EDTA PBS ) 
( 4 )将 24 孔培养板每孔加 G418 选择培养基 2ml ,用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快,置于一个孔中的培养基中,涮洗滤纸块数次,以使黏附的细胞脱落下。镜下观察确认细胞已经脱落后,将滤纸块取出弃掉,其它克隆方法转移同上;(有人在细胞贴壁后再选用培养基) 
( 5 )将移有克隆细胞的 24 孔培养板,继续置 37 ℃ 5%CO2 培养箱培养, 2-5 天; 
( 6 )待细胞长满后, 0.25%Trypsin 消化液消化,并将细胞转移至 6 孔板继续培养,或转入多瓶中扩增,此后可做进一步鉴定工作。


 

Q: 用 G418 做 HEp-2 细胞的建系已经有 2 个月了,已经在细胞瓶中扩大培养,但发现与正常 HEp-2 细胞相比,建系的细胞生长得很慢,细胞间的边界也不是很清楚,而且细胞长得不均匀,这样正常吗?为改变这一状态,我该怎么做呢?谢谢!

A: 基本算正常吧。稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化,有的很明显,比如说细胞变大,生长缓慢,细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等;有的则变化不明显。对于稳定转染的细胞,建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复,因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担,细胞较倾向于甩掉负担轻装前进,这一点对于肿瘤细胞尤甚;另一方面,如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话,这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。在传代过程中,也可以使用正常培养基,但过一段时间一定要用维持剂量的含 G418 的培养基压一压,以除去回复的细胞。


 
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