阻断FC受体方法

如果培养的细胞在细胞表面上有许多 FC 受体（如单核细胞，巨噬细胞），或者细胞在无血清的培养基上培养。通过用人 AB 型血清对细胞进行前处理后，会明显地阻断单克隆抗体的非特异性结合。注意此法并不适用于全血染色，因为在全血染色中有高浓度的血清存在。

 

Ⅰ 、反应体系

A、  抗体

 

1、   第一抗体：常用的或自备的抗体

 

a、    如果第一抗体或自备的抗体能够进行荧光标记（如 FITC ， PE 或其他），请参考直接染色步骤

 

b、   如果第一抗体不能进行荧光标记，则参考间接染色步骤

 

2、   第二抗体：经荧光标记过的多克隆抗体

 

B、  缓冲体系： PBS(Ca²⁺ and Mg²⁺ free,e.g.,Cat.#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA) ＋ 2% 新鲜小牛血清（或者 0.2%BSA ）＋ 0.1% 叠氮钠

 

C、  HAB （ e.g.,Cat.#50009,Irvine Scientific,CA ），其他途径购买的经热失活的 HAB 或经 56 ℃ 失活 1 小时的 HAB 。将其分装成小包装并于 -20 ℃ 贮藏。

 

Ⅱ 、步骤

1、   将要检测的样品按常规的方法制成单细胞悬浮液。在最后的步骤中，用 1ml 预冷的缓冲液至少洗一次，再用预冷的缓冲液将细胞悬浮至浓度为 1 × 10⁷ cells/ml （从而 50 μ l=5 × 10⁵ cells ）

 

检测细胞活力是否达到 90% 。如果细胞活力低于 90% ，必须通过 Ficoll-Hypaque 分离法去除死细胞，否则死细胞会非特异地结合到抗体上的。更适宜的方法是将死细胞通过流式细胞仪分析加以区分，以去除死细胞（具体请参考在通过流式细胞仪捕获前在最后的重新悬浮细胞时加入 propidium iodide 或 7- 氨基 - 放线菌素 D 的方法）

 

2、   加入 50 μ l 的细胞悬浮液至离心管底部。

 

3、   在每一管中分别加入 50 μ l 的 HAB ，并充分混匀，于室温中静置 1 分钟以上。

 

4、   然后加入适宜数量的单克隆抗体至离心管底部，置于冰上。

 

注意：进行两种或三种颜色染色时，请同时将所有的已经荧光标记的抗体同时加入。

 

5、   轻轻振荡后，于 4 ℃ 下暗置 30 分钟。

 

6、   用 1ml 的缓冲液洗两次，然后置于 4 ℃ 下以备通过流式细胞仪进行捕获。

 

间接染色法

 

1-6 、如前所述，用经稀释的未标记的单克隆抗体对细胞样品处理；

 

7、   将细胞沉淀重新悬浮于 50 μ l 的 HAB 中，混匀，于室温中静置 1 分钟以上；

 

8、   加入 50 μ l 经荧光标记的第二抗体稀释液；

 

9、   轻轻振荡后于 4 ℃ 下暗置 20 分钟；

 

10、  用 1ml 的缓冲液洗两次，于 250g 下离心 5 分钟；

 

11、  将样品重新悬浮于 1ml 缓冲液中，于 4 ℃ 下避光保存待用。

 

注意：此法并不适用于 Ig 表面染色或用抗体直接对 FC 受体进行染色。