叶绿体色素理化性质测定

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【原理】
叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的二羧酸酯，故可与碱起皂化反应而生成醇(甲醇和叶绿醇)和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，具有各自特异的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红色荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H＋所取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物 的浸渍标本。
皂化反应式如下：
C32H30ON4MgCOOCH3COOC20H39+2KOHC32H30ON4MgCOOKCOOK+
CH3OH+C20H39OH
皂化叶绿素甲醇叶绿醇
【仪器与用具】
20Ml刻度试管；10Ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯(100Ml)；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管2ml、5Ml各1支；火柴。
【试剂】
95％乙醇；
苯；
醋酸铜粉末；
5％的稀盐酸；
醋酸—醋酸铜溶液：6g醋酸铜溶于100Ml 50％的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成；
KOH—甲醇溶液：20g KOH溶于100Ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。
【方法】
用本实验第一项中提取的叶绿体 色素乙醇溶液和叶绿体悬浮液，进行以下实验。
1光对叶绿素的破坏作用
(1)取4支小试管，其中2支各加入5Ml叶绿体悬浮液，另外2支各加入25Ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95％乙醇稀释1倍。
(2)取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片匀浆的试管，放在直射光下，另外2支放到暗处，40Min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。
2荧光现象的观察取1支20Ml刻度试管加入5Ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同解释原因。
3皂化作用(绿色素与黄色素的分离)
(1)在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入15Ml 20％KOH—甲醇溶液，充分摇匀。
(2)片刻后，加入5Ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1～15Ml蒸馏水，轻轻混匀(勿激烈摇荡)，于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层：下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素A和B(以及少量的叶黄素)；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。
4吸收光谱的观察将上述已分层的试管溶液，用分光镜观察两类色素的吸收光谱，首先让下层绿色素部分对准进光孔，看光谱有何变化；然后再将上层的黄色素溶液对准进光孔，看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。
5H＋和Cu2＋对叶绿素分子 中Mg2＋的取代作用
(1)取2支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液2Ml，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5Ml，再加入5％HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。
(2)当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。
(3)另取醋酸—醋酸铜溶液20Ml，以烧杯盛之。取新鲜植物叶片2片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。
【注意事项】
1在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在30～40℃的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。
2分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。