叶绿体色素的理化性质

（一）原理：

叶绿素是一种极不稳定的化合物。它是一种二羧酸-叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与胡萝卜素分开。

叶绿素与胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被H离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。

去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而胡萝卜素则较稳定。在有氧存在下，叶绿素在甲醇中放置一、二天就转变成加温或室温长期放置会转变成叶绿素a‘和叶绿素b’。因此，在试验中要注意控制这些因素。皂化反应式如下：C32H30NMg

（二）材料、仪器设备和试剂

1. 材料：菠菜叶片

2. 仪器设备：刻度试管，小试管，试管架，石棉网，烧杯，酒精灯，玻棒，铁三角架，刻度吸量管，火柴

3. 试剂：95%乙醇，苯，醋酸铜粉末，5%稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液：用50%醋酸100ml 溶入醋酸铜6g，再加蒸馏水4倍稀释而成；KOH-甲醇溶液：20gKOH溶入100ml 甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。

（三）实验步骤

本实验第一项中提取的叶绿体色素乙醇溶液进行以下实验：

1. 光对叶绿素的破坏作用

（1） 取1支小试管，各加入2.5ml 叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。其中1支放在直射光下，另外1支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。

（2） 另取本实验中用圆形滤纸层析分离成的色谱一张，通过中线裁成两半，一半放在直射光下，另一半放在暗中，半小时后比较两张色谱上的四种色素的颜色各有何变化。

2. 荧光现象的观察

取一支20ml 刻度试管加入5ml 浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光反射光颜色有何不同，解释原因。

3. 皂化作用（绿色素和黄色素的分离）

（1） 在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。

（2） 片刻后，加入5ml 苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1-1.5ml蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡）， 于试管架上静置分层。

若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿试管滴加，边滴加边摇动，直到溶液开 始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（还有少量的叶黄素），上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。

4. H+和Cu+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用

（1） 取两支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液2ml，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液5ml，再加入5%HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。

（2） 当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。

（3） 另取醋酸-醋酸铜溶液20ml，置于烧杯中。取新鲜植物叶两片，放入烧杯中，用酒精慢慢加热，

随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。

注意事项：在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液混浊，且不分。