叶绿体色素的理化性质的鉴定

原理

叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被H取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。

器材与试剂

器材：FS分液漏斗、移液管、试管与试管架、量筒、烧杯、酒精灯、滴管、药匙等。

试剂：石油醚(60-90℃)、醋酸铜粉末、醋酸、KOH的甲醇溶液(30gKOH溶于甲醇定容于100ml)、醋酸铜的醋酸溶液(6g醋酸铜溶于100ml50％醋酸溶液中)。

方法与步骤

1.用石油醚萃取丙酮提取液中的叶绿体色素。在用丙酮从鲜叶中提取的色素粗提液中不仅含有叶绿体色素，而且还含有可溶于丙酮的其他化合物。为了使被分离崐色素更好地用于理化性质的观察，须把丙酮提取液中的色素转移到石油醚中，具体方法如下：

将丙酮提取液倒入分液漏斗中，加等量或半量的石油醚(沸点为60-90℃)，用力振荡后静置，待分层清晰后弃去丙酮层。加蒸馏水洗石油醚3-4次，轻轻摇动，洗去石油醚中的丙酮和溶于水的其他物质。每次洗涤后需静止片刻，然后弃去下层的丙酮水层，最后将石油醚色素提取液置棕色瓶中备用。

2.叶绿素的荧光观察：向试管中倒入3ml石油醚色素提取液，从与入射光垂直的方向可观察到血红色的荧光。比较色素溶液在反射光与透射光下的颜色。

3.叶绿素的皂化反应：向观察过荧光的试管，沿壁缓缓加入2ml新配制的30％KOH甲醇溶液，可看到KOH溶液沉在下层。然后摇动，静置10分钟，观察变化情况。

4.铜代叶绿素反应：取上述叶绿体色素5ml，放入试管中，加50％醋酸数滴摇匀，观察溶液颜色的变化。

当溶液变褐色后，倾出一半与另一试管，投入醋酸铜粉末少许，微微加热，观察溶液颜色的变化，与未加醋酸铜的一半相比较。

另取含醋酸铜的醋酸溶液20ml，放入烧杯，取新鲜绿叶一片，放入溶液中，用酒精灯缓缓加热，观察叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止，解释上述颜色的变化过程。

5.光对叶绿素的破坏作用：取二个试管，分别装叶绿体色素提取液3ml，一个置暗处或用黑纸包裹，另一个置于强光(太阳或强光源)下，经1-2小时后，观察二管溶液的颜色变化。

也可用本实验二中已色层分析的层析纸，剪截成两半，每个半张上都有相同色素带，半张放在暗处，半张置于光下，半小时后比较两张色谱上各色带的颜色变化。